Aula 2: Purificação de Proteínas (revisão) e Determinação de Estruturas (difração de raio-x)

Transcrição

1 Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho Disciplina de Engenharia de Proteínas Curso de Ciências Biológicas 2º Semestre de 2016 Aula 2: Purificação de Proteínas (revisão) e Determinação de Estruturas (difração de raio-x) Prof. Marcos Túlio de Oliveira mtoliveira@fcav.unesp.br

2 Trabalhando com Proteínas Compreensão sobre estrutura e função de proteínas proteínas individuais. Separadas de outras de forma pura considerando suas propriedades. Proteína pura essencial para que suas propriedades e atividades sejam determinadas.

3 Análise de Proteínas Absorbância; Eletroforese em gel desnaturante; Western blot (imunoblot).

4 A 280 A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos. A medida da luz absorvida permite interferir sobre a concentração de soluto em uma determinada solução ou material biológico.

5 Métodos de Quantificação Proteica Principais ensaios de quantificação de proteínas Fonte: Quantitation.html

6 Eletroforese de Proteínas (SDS-PAGE) Eletroforese: separação com base na migração de proteínas carregadas em um campo elétrico. Não é utilizado para purificar proteínas porque afetam sua estrutura e a função.

7 Eletroforese de Proteínas Método analítico: útil tanto para separar quanto para visualizar proteínas. Estimar rapidamente o número de diferentes proteínas presentes em uma amostra ou o grau de pureza. Permite determinação da massa molecular aproximada.

8 Eletroforese de Proteínas Géis de polímero de acrilamida - poliacrilamida. Migração afetada pela massa-carga e forma da proteína.

9 Eletroforese de Proteínas SDS-PAGE SDS (sodium dodecyl sulfate) 1 molécula de SDS para cada 2 resíduos de aminoácidos. Contribui com grande carga negativa. SDS desdobra parcialmente as proteínas, assumindo forma semelhantes.

10 Eletroforese de Proteínas Separação, quase exclusivamente, pela massa molecular. Polipeptídeos menores migram mais rápido. Visualização com Coomassie ou Nitrato de Prata. Aproximação da massa molecular para proteínas desconhecidas.

11 Western blot (imunoblot)

12 Trabalhando com Proteínas Como purificar uma proteína Métodos clássicos Diferença de propriedades das proteínas: carga, tamanho, ligantes. Métodos modernos Clonagem de DNA, sequenciamento genômico, proteínas recombinantes, etc.

13 Trabalhando com Proteínas Proteína nova precedentes estabelecidos e bom senso. Mais de um método de purificação utilizado. Escolha do método: empírico. Levar em consideração métodos descritos para proteínas semelhantes. Iniciar com métodos de baixo custo.

14 Purificação Proteica: Fonte Proteica

15 Estratégia Geral para Obtenção da Proteína Purificada Extração Isolamento 1. Material de Partida Extrato Bruto 2. Desintegração celular Separação Fracionamento Solubilidade Tamanho Carga Afinidade Ligação Diálise Ultra filtração Coluna Cromatografica

16 Purificação Proteica: Isolamento Extrato Bruto

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18 Métodos Cromatográficos Cromatografia em Coluna Poderoso método de fracionamento. Diferença de tamanho, carga, afinidade de ligação e outros. Velocidade da migração depende da propriedade da proteína.

19 Lehninger, 5ª ed. 2010

20 Métodos Cromatográficos Tipos de Cromatografia em Coluna: o Troca Iônica (Aniônica e Catiônica); o Gel-filtração ou Exclusão por tamanho; o Afinidade; o Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC).

21 Cromatografia de troca iônica Baseado nas diferenças de sinal e magnitude da carga elétrica líquida de proteínas em um dado ph. Resina: o Trocadora de cátions (grupos aniônicos); o Trocadora de ânions (grupos catiônicos).

22 Cromatografia de troca iônica Afinidade afetada: o ph (determina o estado de ionização da molécula); o concentração dos íons dos sais livres que competem na solução circundante.

23 Cromatografia de exclusão por tamanho Ou gel-filtração. Separação por tamanho. Fase sólida: grânulos de polímero com ligações cruzadas, com poros de tamanho específico. Proteínas grandes saem da coluna antes que as pequenas. maiores menores

24 Cromatografia de afinidade Baseado na afinidade de ligação. Resina: ligante (grupo químico covalentemente ligado). Proteínas com afinidade se ligam ao ligante. Lehninger, 5ª ed. 2010

25 0.25 M NaSCN Gradient M NaSCN 1.5 M NaSCN C+ Ind S FT W1 Blue-Sepharose S FT W1 W2 Gradient mm KPO mm KPO Fosfocelulose

26 Coloração com Prata Western Blot Yuxun Wang et al. J. Biol. Chem. 1997;272: by American Society for Biochemistry and Molecular Biology

27 Proteínas Recombinantes

28 Cromatografia de Afinidade

29 Fonte:V. Gaberc-Porekar, V. Menartr, 2001.

30 Cromatografia de Afinidade Ni-NTA

31 Cromatografia de Afinidade Ni-NTA

32 Cromatografia de Afinidade Ni-NTA Coloração com Coomassie Blue Western Blot

33 Cromatografia de Afinidade Ni-NTA Coloração com Coomassie Blue Western Blot Anticorpos que reconhecem Poli-histidina!!!

34 Como produzir a proteína contendo a cauda de poli-histidina?

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36 Sistemas de Expressão

37 Representação Esquemática de um Vetor de Expressão Procariótico Fonte: Hanning e Makrides, 1998.

38 Representação Esquemática de um Vetor de Expressão Procariótico Fonte: Hanning e Makrides, 1998.

39 Representação Esquemática de um Vetor de Expressão Procariótico ou Fonte: Hanning e Makrides, códons para His (CAT ou CAC)

40 Inclusão dos códons de His

41 Representação Esquemática de um Vetor de Expressão para Células Sf9

42 Representação Esquemática de um Vetor de Expressão para Células Sf9

43 Representação Esquemática Vetor de Expressão para Células Humanas

44 Tags de Fusão de Proteína Comuns

45 Proteínas Recombinantes então resolvem dois problemas comuns da purificação de proteínas nativas: 1 - Abundância 2 - Especificidade pela Coluna Cromatográfica

46 Exemplo: a DNA polymerase γ de Drosophila melanogaster Nativa Recombinante Quilos de ovos de D. melanogaster Extrato Celular Centrifugação diferencial Coluna de Fosfocelulose Precipitação com (NH 4 ) 2 SO 4 Coluna de DNAcelulose Coluna de Octilsefarose Coluna de Blueagarose Sedimentação em Gradiente de Glicerol Expressão em Sf9 Extrato Celular Coluna de Fosfocelulose Precipitação com (NH 4 ) 2 SO 4 Coluna de Ni-NTA Sedimentação em Gradiente de Glicerol

47 Exemplo: a DNA polymerase γ de Drosophila melanogaster Nativa vs Recombinante

48 Determinação da Estrutura Tridimensional de Proteínas por Difração de Raios-X

49 Níveis estruturais das proteínas Fonte: Lehninger, ªed.

50 Estrutura proteica A conformação tridimensional (3D) depende da sequência de aminoácidos A função depende da estrutura Cada proteína existe em um ou em pequeno número de formas estruturalmente estáveis As principais forças para a estabilização de estruturas são forças não-covalentes

51 Estrutura tridimensional Arranjo espacial de todos os átomos de uma proteína conformação As conformações possíveis de uma proteína incluem qualquer estado estrutural que ela possa assumir sem a quebra das ligações covalentes. Porém, poucas são as conformações nativas. Algumas proteínas são formadas por mais de um complexo polipeptídico (quaternária)

52 Determinação da estrutura tridimensional proteica O primeiro passo para o estudo sobre as propriedades de um composto orgânico é a determinação de suas estruturas cristalinas. Diversas propriedades estão intimamente ligadas à maneira como os átomos estão dispostos pela molécula.

53 Mas...o que são cristais? Cristais são arranjos atômicos ou moleculares cuja estrutura se repete numa forma periódica tridimensional. Exemplo: NaCl, cuja estrutura consiste em átomos de Sódio e Cloro dispostos de forma que um átomo de sódio terá sempre átomos de cloro como vizinhos e vice-versa.

54 Sólidos cristalinos Formas regulares e simétricas assim como a ordenação das partículas que os formam.

55 Como observar os cristais? O estudo da estrutura cristalina não é possível através da microscopia óptica. Os microscópios ópticos possuem uma limitação física, ditada pelo comprimento de onda da luz visível.

56 Como observar os cristais? Para resolver objetos tão pequenos quanto proteínas, precisamos usar raios X, que possuem comprimentos de onda na faixa de 0,7 a 1,5 Å (0,07 a 0,15 nm).

57 Cristalografia de raios-x Uma das técnicas mais conhecidas para a determinação dos padrões de uma estrutura é cristalografia por difração de raios-x. O primeiro passo é obter proteína com alto grau de pureza!!! Segundo, obter cristais!!!

58 Cristalografia de raios-x

59 Cristalografia de raios-x Raio X incide no cristal, onde parte de sua energia é absorvida e reemitida em todas as direções (cada átomo se torna uma fonte secundária de raios X);

60 Padrão de difração dos raios x Fonte: Paula Kuser Falcão.

61 Cristalografia de raios-x Não há lentes que reagrupem os raios X para formar a imagem. Ao invés disso, o padrão de difração dos raios X é coletado diretamente e a imagem é reconstruída por técnicas matemáticas.

62 Cristalografia de raios-x A difração de raios-x aplicada à análise de cristais de macromoléculas biológicas tem influenciado a bioquímica estrutural, tendo contribuído para o conhecimento da estrutura 3D de proteínas, ácidos nucleicos, vírus e outras macromoléculas.

63 Padrão de difração dos raios x

64 Cristalografia de raios-x A quantidade de informação obtida em uma cristalografia por raios X depende do grau de organização estrutural da amostra. Informações da estrutura 3D detalhadas precisam de cristais proteicos altamente ordenados. Dificuldade em cristalizar várias proteínas.

65 Cristalografia de raios-x O ambiente físico em um cristal não é idêntico ao em solução ou na célula viva. Poucas informações são fornecidas em termos de movimentos moleculares no interior da proteína.

66 A partir da cristalografia de raios-x, é possível... Compreender melhor os princípios básicos da arquitetura proteica; Estudar em nível atômico os centros catalíticos de enzimas; Compreender a especificidade das reações que as enzimas catalisam; Compreender a relação existente entre sequencia primária, estrutura e função.

67 ESQUEMA DA DETERMINAÇÃO DA ESTRUTURA 3D DE PROTEÍNAS

68 Exemplo de proteínas cristalizadas Fonte: Paula Kuser Falcão.

69 Oliveira et al Genome Biol Evol.

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