II - ELECTROFORESE DE AMINOÁCIDOS

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1 II - ELECTROFORESE DE AMINOÁCIDOS Introdução Muitas moléculas biológicas apresentam carga eléctrica cujo valor e sinal depende das suas características e também do ph e da composição do meio em que se encontram. Estas moléculas carregadas electricamente (iões), quando colocadas num local onde é aplicado um campo eléctrico, migram em solução para os eléctrodos de sinal contrário ao da sua carga global. Na técnica que é designada por electroforese este fenómeno é utilizado para separar moléculas. Para evitar fenómenos de convecção a electroforese pode ter lugar num meio de suporte. Um dos meios de suporte que pode ser utilizado é o papel de filtro, o qual é impregnado com uma solução tampão. Na electroforese em papel a amostra é aplicada num ponto de uma tira de papel (origem) a meia distância entre os compartimentos dos dois eléctrodos, cátodo e ânodo, de uma tina para electroforese. Esses compartimentos contêm uma solução tampão de ph adequado. Uma vez criado o campo eléctrico, as substâncias carregadas electricamente movimentam-se no sentido do compartimento do eléctrodo de carga contrária (as com carga positiva para o cátodo e as com carga negativa para o ânodo), com velocidades que dependem das suas dimensões e da sua carga eléctrica. Para os aminoácidos a carga eléctrica será determinada pelo valor do ph da solução tampão. A aplicação do campo eléctrico é feita por um período de tempo inferior ao que seria necessário para que as substâncias atingissem os eléctrodos, pelo que elas ficam separadas no papel em pontos intermédios entre os eléctrodos. As tiras de papel são então submetidas a uma secagem rápida, para evitar a difusão das substâncias separadas (outra das razões por que se usa um meio de suporte), e reveladas por um método químico apropriado, que, no caso dos aminoácidos, será uma reacção com o reagente químico ninidrina. Desta reacção, que se dá a quente em meio neutro ou ligeiramente alcalino, resulta um composto corado de cor azulada. Numa solução tampão tem-se uma mistura de um ácido fraco com a sua base conjugada. Exemplificando com o caso do ácido acético, o ph de uma solução contendo uma certa quantidade da sua forma ácida (HAc) e da sua forma básica (Ac ), pode ser previsto com base na eq. de Henderson Hasselbalch: 5

2 [HAc] ph = pk a log [Ac ] Se se pretende que o ph se mantenha constante, a razão entre as concentrações do ácido e da base conjugada não deve ser senão ligeiramente alterada pela adição de pequenas quantidades de ácido ou de base. A adição de ácido (H + ) conduz à formação de HAc não ionizado e consequente consumo do H + adicionado: H + (aq) + Ac (aq) HAc (aq) e a de base (OH ) conduz à ionização de HAc e consequente consumo do OH adicionado: HAc (aq) + OH (aq) Ac (aq) + H 2 O pelo que, se as concentrações de HAc e Ac forem elevadas, as adições de H + ou OH terão um efeito muito pequeno na razão [Ac ]/[HAc] e o ph será pouco afectado. O poder tampão de uma solução tampão depende do volume da solução e das concentrações dos seus componentes HAc e Ac. Corresponde ao número de moles de H + ou OH que é necessário adicionar a um litro de solução para que o seu ph varie de uma unidade. Uma solução tampão pode ser preparada de 3 maneiras: 1) Misturam-se quantidades determinadas de cada uma das duas formas de um par conjugado ácido-base e dilui-se a um determinado volume. 2) A uma quantidade determinada da forma ácida de um par conjugado ácido-base adicionase uma quantidade determinada de base forte e dilui-se a mistura a um determinado volume. 3) A uma quantidade determinada da forma básica de um par conjugado ácido-base adicionase uma quantidade determinada de ácido forte e dilui-se a mistura a um determinado volume. A molaridade de um tampão refere-se sempre à concentração total da espécie (par conjugado ácido-base) que se usa para a preparação do tampão. Por exemplo, um tampão 0,5 M em fosfato com ph ~7,2 é um tampão em que a soma das concentrações de H 2 PO 4 e de HPO 4 2 é de 0,5 mol L 1. Nestas condições experimentais as concentrações de H 3 PO 4 e de PO 4 3 são desprezáveis. OBJECTIVO DO TRABALHO O objectivo do trabalho consiste no estudo por electroforese em papel da mobilidade de três aminoácidos (ácido glutâmico, alanina e lisina) a um determinado valor de ph e da sua eventual separação numa mistura ao mesmo valor de ph. Tendo em atenção os resultados obtidos a vários valores de ph é possível fazer uma estimativa para os valores dos respectivos pontos isoeléctricos. REAGENTES Solução tampão Solução de ácido glutâmico a 2% p/v preparada com solução tampão (solução E). 6

3 Solução de alanina a 2% p/v preparada com solução tampão (solução A). Solução de lisina a 2% p/v preparada com solução tampão (solução K). Solução contendo uma mistura dos três aminoácidos (solução M). Solução de ninidrina com ph adequado MATERIAL Tina para electroforese 4 tiras de papel Whatman 3 MM Chr (28 3 cm) Medidor de ph e eléctrodos Pulverizadores Luvas Fonte de alimentação para electroforese Secador Seringas TÉCNICA I. Preparação de uma solução tampão de ph 1) Comece por preparar 500 ml de cada uma das duas soluções necessárias para a preparação da solução tampão pretendida. 1) Para preparar 1 L da solução tampão pretendida adicione, usando provetas de capacidade adequada ao volume a medir, X ml + Y ml ml de água destilada directamente para dentro de um frasco de 1 L, agitando em seguida a solução final assim preparada. Para saber qual o tampão a preparar e valores de X e Y consulte o professor. 2) Meça o ph da solução tampão preparada. 3) Meça e tome nota do valor da temperatura da solução. II. Preparação de soluções de três aminoácidos (alanina, ácido glutâmico e lisina) 1) Pese cerca de 20 mg de ácido glutâmico para um pequeno tubo, adicione 1 ml da solução tampão preparada e dissolva agitando o conteúdo do tubo. Rotule o tubo com a letra E e a indicação do grupo. 2) Repita a operação usando alanina em vez de ácido glutâmico (letra A). 3) Repita a operação usando lisina (letra K). 4) Pipete 0,3 ml de cada uma das três soluções preparadas (E, A e K) para um pequeno tubo e agite para homogeneizar. Rotule o tubo com a letra M e a indicação do grupo. III. Electroforese: preparação do material e realização experimental Obs. prévia: A pulverização com ninidrina (passo 7) deverá ser efectuada na hotte. Usar sempre luvas para manusear as tiras de papel. 1) Desenhar levemente a lápis uma linha transversal (origem) no centro das tiras de papel, assinalar o centro das linhas com uma pequena cruz, identificar a lápis as tiras numa das extremidades com o nome da amostra a colocar e marcar as extremidades catódica (com C) e anódica (com A). 2) Com uma seringa aplicar na origem de cada uma das quatro tiras de papel uma pequena gota, respectivamente, de cada uma das soluções E, A e K e M, e secar imediatamente a tira com um secador para evitar a difusão da gota. 3) Pulverizar as tiras de papel com a solução tampão usando um pulverizador e protegendo a parte central da tira, que contém a amostra, com uma régua de plástico de modo a conservá-la seca e a evitar a difusão da amostra. 7

4 4) Colocar as quatro tiras de papel na tina de electroforese depois de a ter enchido com a solução tampão. 5) Ligar os eléctrodos à fonte de alimentação e aplicar uma diferença de potencial de 200 V durante quarenta minutos. 6) Ao fim desse tempo desligar a fonte de alimentação, retirar rapidamente da tina as tiras de papel e secá-las rapidamente com um secador. 7) Pulverizar as tiras de papel secas com a solução reveladora de ninidrina de ph adequado e aqueçê-las com o secador. 8) Com um lápis, delimitar as manchas coradas que aparecerem nas tiras de papel e medir as distâncias (em mm) da origem até ao centro de cada mancha. BIBLIOGRAFIA M. Melvin, Electrophoresis, ed. ACOL, John Wiley & Sons, Chichester, J.R. Sargent, Methods in Zone Electrophoresis, BDH Chemicals Ltd, Poole, ANEXO PREPARAÇÃO DE SOLUÇÕES TAMPÃO (Aos volumes indicados ainda se adiciona 500 ml de água) X ml de NaCH 3 COO (0,2 M) Y ml de HCH 3 COO (0,2 M) X ml de Na 2 HPO 4 (0,2 M) Y ml de NaH 2 PO 4 (0,2 M) X ml de Na 2 CO 3 (0,2 M) Y ml de NaHCO 3 (0,2 M) VALORES DE pk a DOS ÁCIDOS USADOS NAS SOLUÇÕES TAMPÃO Ácido acético (HAc) Ácido fosfórico (H 3 PO 4 ) Ácido carbónico (H 2 CO 3 ) pk a1 4,76 2,15 6,35 pk a2-7,20 10,33 pk a3-12,35-8

5 ELECTROFORESE DE AMINOÁCIDOS FOLHA DE RESULTADOS GRUPO: DATA:... TURMA:... RESULTADOS EXPERIMENTAIS Preparação de uma solução tampão:... ml de ml de... ph da solução tampão preparada = temperatura = Fórmulas estruturais para as formas predominantes dos aminoácidos ao valor de ph a que foi realizada a electroforese Ácido glutâmico Alanina Lisina Distância percorrida por cada aminoácido (em mm) * Aminoácido isolado Na mistura Ácido glutâmico Alanina Lisina Carga eléctrica das espécies predominantes dos aminoácidos ao ph a que foi realizada a electroforese Estimativa dos pontos isoeléctricos dos aminoácidos - PI * Indique o sentido do movimento com + (movimento no sentido do cátodo) ou com (movimento no sentido do ânodo). 9