BIOLOGIA MOLECULAR. João Carlos Bespalhok Filho Professor Associado DFF/UFPR

Transcrição

1 BIOLOGIA MOLECULAR João Carlos Bespalhok Filho Professor Associado DFF/UFPR

2 Definição Biologia Molecular é o campo da biologia que estuda a composição, estrutura e interações de moléculas celulares -tais como ácidos nucléicose proteínas -que realizam os processos biológicos essenciais para as funções e manutenção da célula.

3 Esquema da relação entre a bioquímica (biochemistry), a genética (genetics) e a biologia molecular (molecular biology).

4 BIOLOGIA MOLECULAR Possibilita a manipulação de moléculas => introdução de genes em um genoma receptor Depende: Tecnologia do DNA recombinante Enzimas replicar, cortar e ligar o DNA Bases nitrogenadas

5 DNA RECOMBINANTE Ferramenta permite: Clivar DNA com enzimas de restrição Inserir DNA eucariótico em bactérias Determinar a sequência de um fragmento de DNA Amplificar e sintetizar DNA Recombinar fragmentos de DNA, etc.

6 Alguns objetivos que a tecnologia do DNA recombinante tornou possível Isolar um gene em particular, parte de um gene ou uma região do genoma; Produzir proteína de interesse em larga escala; Aumentar a eficiência da produção de enzimas e drogas para comercialização; Modificar organismos existentes para que expressem uma característica de interesse que não seja codificada pelo genoma = Transgênicos

7 AGRICULTURA Plantas tolerantes à Doenças e a Pragas Feijão resistente ao vírus do mosaico dourado e Mamão papaya resistente ao vírus da mancha anelar Milho, algodão, soja (Bt) = resistentes ao ataque de insetos Plantas tolerantes à Herbicidas Soja e Milho (RR) = tolerante ao glifosato Soja = tolerante ao 2,4-D Plantas tolerantes ao estresse ambiental (Seca, frio, calor, salinidade e acidez) Cana-de açúcar tolerante à seca Plantas com melhorias nutricionais (vitaminas e aa) Arroz dourado (Golden rice), rico em betacaroteno, precursor da vitamina A - evitar a cegueira noturna e desnutrição

8 DNA, RNA ÁCIDOS NUCLEICOS E SUAS PROPRIEDADES

9 GENE

10 GENE Conceito: Sequência ordenada de nucleotídeos DNA Expressão Codifica um produto funcional (proteína ou molécula de RNA)

11 DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR A informação genética: Perpetuada através da Replicação do DNA (Ácido nucleico) Expressa através de dois processos: Transcrição e Tradução

12 DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR Replicação DNA DNA Transcrição Transcrição Reversa RNA Tradução PROTEÍNA

13 DNA E RNA: ÁCIDOS NUCLEICOS Composição química: NUCLEOTÍDEO

14 FOSFATO RNA e DNA 5 Nucleotídeo

15 AÇÚCAR PENTOSES RNA: Ribose DNA: Desoxirribose

16 BASES NITROGENADAS Bases Púricas e Pirimídicas = Anéis Aromáticos Heterocíclicos PURINAS Bicíclicas Adenina Guanina PIRIMIDINAS Monocíclicas Citosina Uracila Timina

17 BASES NITROGENADAS DNA RNA A C G T A C G U PAREAMENTOS _ A T C G A U

18 DNA : POLÍMERO DE NUCLEOTÍDEOS NUCLEOTÍDEOS Filamento de nucleotídeos 5 Ligação fosfod diéster HO 3 HO 3 HO 3 HO 3 3

19 DNA : ESTRUTURA Estrutura Plana 2 Fitas de nucleotídeos Complementares e Invertidas A = T 2 pontes H G C 3 pontes H

20 Extremidade 5 = Fosfato (PO 4 ) DNA: estrutura tridimensional Duas fitas enroladas, complementares entre si e invertidas Cada fita: composta por uma sequência linear de nucleotídeos Estrutura Helicoidal em dupla hélice Leitura e Escrita 5 3 Extremidade 3 = Hidroxila (HO) (Watson & Crick, 1953)

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22 REPLICAÇÃO

23 COMO O DNA SE REPLICA? Replicação: capacidade do DNA de originar cópias idênticas (auto duplicação) O processo é dividido em 3 etapas: Etapa Enzima Função 1ª DNA Helicase Desenrola as duas hélices e rompe as pontes de hidrogênio entre os nucleotídeos => separa fitas 2ª DNA Polimerase Encaixa os nucleotídeos na fita molde 3ª DNA Ligase Realiza a ligação dos nucleotídeos (fragmentos de Okasaki) Primase (RNA polimerase) : confecção de primers para que a DNA polimerase inicie a síntese

24 DNA : DUPLICAÇÃO Origem de Replicação: regiões ricas em AT = início da replicação DNA polimerase: requer primers para iniciar a síntese (5-3 ) Fita contínua Helicase Primers (Primase) DNA polimerase Fita descontínua DNA Ligase Forquilha de replicação

25 DNA : DUPLICAÇÃO Semiconservativa

26 TRANSCRIÇÃO

27 TRANSCRIÇÃO: DNA => RNA RNA : POLÍMERO DE NUCLEOTÍDEOS 1. DNA se abre: RNA polimerase (bolha de transcrição ) 2. Pareamento de novos nucleotídeos (ribose e uracila) na fita molde de DNA 3. RNA pronto se solta e migra para o citoplasma 4. DNA se recompõe

28 RNA : ESTRUTURA Bolha de Transcrição DNA se abre Pareamento de novos nucleotídeos (ribose e uracila) na fita molde de DNA RNA pronto se solta e migra para o citoplasma DNA se recompõe RNA polimerase: não necessita primers, abre e renatura o DNA

29 TRANSCRIÇÃO Enzima responsável: RNA polimerase Início da Transcrição: Região Promotora pequena sequência de nucleotídeos reconhecida pela RNA polimerase como ponto onde deve se ligar ao DNA Exemplos promotores: Região TATA box => -10: 5 -TATAAT- 3 => -35: 5 -TTGACA- 3

30 Término da Transcrição: TRANSCRIÇÃO RNA polimerase encontra um Terminador Sequência nt que determina o desligamento da RNA polimerase Região com pares consecutivos de A/U Região rica em G+C (dependente de proteína) O complexo de transcrição se dissocia e há liberação da molécula de RNA

31 RNA : ESTRUTURA RNA: Uma fita simples de nucleotídeos

32 RNA : ESTRUTURA Fita simples (única), helicoidal Regiões complementares Formando grampos e alças

33 TIPOS DE RNA RNA mensageiro (mrna) => informação genética para a sequência de aminoácidos das proteína RNA ribossômico (rrna) => constituinte dos ribossomos RNA transportador (trna) => identifica e transporta os aminoácidos até os ribossomos

34 TRADUÇÃO

35 TRADUÇÃO Síntese de proteínas Converte trincas de nt RNA => Aminoácidos => Proteína Local: Ribossomos (citoplasma) Início da Tradução: Códon de iniciação => AUG (Metionina) Término da Tradução: Códon de terminação => Não codifica aminoácido Ex: UGA, UAG, UAA

36 TRADUÇÃO

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38 PROPRIEDADES DO DNA

39 PROPRIEDADES DO DNA DESNATURAÇÃO rompimento das pontes de hidrogênio entre as cadeias complementares do DNA RENATURAÇÃO reanelamento das pontes de hidrogênio entre as cadeias complementares do DNA => Fenômenos físicos fundamentais para os processos de replicação e transcrição Esses processos podem ser realizados in vitro

40 MANIPULAÇÃO DO DNA A Desnaturação pode ser obtida através de: Aumento de temperatura Agentes desnaturantes (formamida e dimetil-sulfóxido) Titulação com ácido ou base Tm ( C) = 69,3 + 0,41 (GC%) Temperatura média de fusão

41 MANIPULAÇÃO DO DNA A Renaturação pode ser obtida através de: Diminuição lenta de temperatura Resfriamento abrupto: colapso do DNA T (anelamento) ( o C) = Tm 25 o C

42 MANIPULAÇÃO DO DNA Enzimas => replicar, cortar e ligar Replicação: DNA polimerase e helicase Transcrição: RNA polimerase Corte do DNA: Enzimas de Restrição Ligação de DNA: DNA-ligases Acesso a vários tipos de enzimas: Tornou possível transferir sequências específicas de DNA de uma molécula para outra

43 MANIPULAÇÃO DO DNA Enzimas de Restrição Reconhecem e cortam sequências específicas do DNA Encontradas em ampla variedade de procariotos (clivar moléculas de DNA exógeno) Isolamento de genes e criação de moléculas novas de DNA Reconhecem sequências de 4 a 8 nt Sítios de Clivagem: hidrolisa ligações fosfodiéster

44 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Enzimas com diferentes especificidades já foram purificadas: Denominação Origem Sequência de Reconhecimento Abreviação de 3 letras do nome da espécie Seguida da designação da linhagem Número Romano: se mais de uma enzima é produzida

45 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Sequências Palindrômicas (repetições invertidas): sequência das duas cadeias é igual quando for lida de 5 para

46 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Extremidade Coesiva Extremidade Cega (Abrupta) Clonagem: Mais utilizados fragmentos gerados com extremidades coesivas > eficiência de ligação

47 Isoesquisômeros: ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Enzimas provenientes de organismos diferentes que reconhecem e cortam a mesma sequência de bases

48 ENZIMAS DE LIGAÇÃO Restabelecem as ligações fosfodiéster entre os nucleotídeos (hidroxila 3 + fosfato 5 ) Capacidade de ligar dois cortes produzidos pela mesma enzima de restrição O DNA 3 OH + - O P O 5 DNA O - O DNA-Ligase ATP DNA ou NADligase Ex: T4 DNA ligase DNA 3 O P O 5 - O DNA

49 DNA RECOMBINANTE

50 DNA RECOMBINANTE

51 DNA RECOMBINANTE