Introdução à Biologia Celular, Histologia e Embriologia e seus métodos de estudo

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1 Morfologia Biologia Celular, Histologia e Embriologia Docentes Prof. Dr. Cesar Martins: cmartins@ibb.unesp.br Prof. Dr. Cláudio Oliveira Prof. Dr. Rafael H Nóbrega Introdução à Biologia Celular, Histologia e Embriologia e seus métodos de estudo 1

2 Desenvolvimento da Microscopia Invenção de lentes de aumento: levou ao descobrimento do mundo microscópico. A invenção do microscópio Microscópio óptico Microscópio eletrônico Avanços em Biologia Molecular Visão panorâmica da célula Algumas grandezas... 1km! 1.000m 1m! 100 cm 1cm! 10 mm 1mm! 1000 µm 1 µm! 1000 nm 1Å (Angstron)! m 2

3 Visão panorâmica da célula Aumento e Poder de Resolução Resolução: menor distância para que duas partículas apareçam como objetos separados. O limite de resolução da Microscopia Óptica é de 0,2 µm Visão panorâmica da célula 3

4 Desenvolvimento da Microscopia -Microscópio Óptico (luz) -Microscópio Eletrônico (elétrons) Desenvolvimento da Microscopia Microscópio óptico utiliza feixes de luz Sistemas de lentes (condensador, objetiva e ocular) O limite de resolução do MO é de 0,2 µm e depende essencialmente da objetiva. 4

5 Desenvolvimento da Microscopia Microscópio óptico Desenvolvimento da Microscopia Microscópio óptico de campo claro 5

6 Desenvolvimento da Microscopia Microscópio óptico de fluorescência Desenvolvimento da Microscopia Microscópio óptico de fluorescência 6

7 Desenvolvimento da Microscopia Microscópio óptico confocal Desenvolvimento da Microscopia Outros tipos de microscópios ópticos Iluminação direta (sem coloração) Contraste de fase (refração da luz) Contraste diferencial de interferência (refração da luz) 7

8 Desenvolvimento da Microscopia Microscópio eletrônico -utiliza feixes de elétrons -lentes eletromagnéticas! Alta resolução, abaixo de 0,3nm.! Necessita de cortes muito finos (0,02 a 0,1 µm)! Material biológico é impregnado com metais pesados como ósmio, chumbo e urânio! Imagem elétron-densa (escura) e elétronlúcida (clara) Estrutura e funcionamento 8

9 Desenvolvimento da Microscopia Microscópio eletrônico de transmissão Microscópio eletrônico de varredura! Alta resolução! Fragmentos maiores ou tecidos inteiros! Material biológico é recoberto com metais como ouro ou platina! Estrutura tridimensional (3D) 9

10 Desenvolvimento da Microscopia Microscópio eletrônico de varredura MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA Microscópio eletrônico de varredura 10

11 Centro de Microscopia Eletrônica UNESP - Botucatu MEV MET 11

12 Preparação de material para análise ao microscópio As células e tecidos precisam estar perfeitamente preservados, apresentando a mesma estrutura e composição química que possuíam quando vivas. Preparação de material para análise ao microscópio Fixação Preserva a morfologia e composição do tecido. Fixador mais utilizado! Formaldeído. Para microscopia eletrônica (ME) os tecidos necessitam de tratamentos especiais em soluções de aldeído glutárico e tetróxido de ósmio. 12

13 Preparação de material para análise ao microscópio Lavagem Preparação de material para análise ao microscópio Desidratação Retirada da água presente nos tecidos através de sucessivos banhos em uma série de etanol (70%!80%!90%!100%). 13

14 Preparação de material para análise ao microscópio Diafanização ou clareamento Substituição do etanol por líquido miscível (geralmente xilol) com o meio de impregnação e retirada de lipídios. Preparação de material para análise ao microscópio Meio de impregnação Substituição do líquido (xilol) por parafina ou resina sintética. A resina sintética possibilita cortes mais finos (1 a 2 µm). O ME necessita de cortes muito finos (0,02 a 0,1 µm) e por isso utiliza se resinas mais duras. Neste caso os cortes são feitos com navalhas de vidro ou diamante. 14

15 Preparação de material para análise ao microscópio Meio de inclusão Suporte para o tecido impregnado. Preparação de material para análise ao microscópio Tecido preparado para análise ao Microscópio Eletrônico 15

16 Preparação de material para análise ao microscópio Micrótomo Instrumento para cortar finas fatias do tecido (menores que 1µm de espessura). Preparação de material para análise ao microscópio Micrótomo automatizado Permite a obtenção rápida de cortes sem passar pelas etapas descritas antes. 16

17 Preparação de material para análise ao microscópio Micrótomo Realizando cortes do material Preparação de material para análise ao microscópio Micrótomo Instrumento para cortar finas fatias do tecido (menores que 1µm de espessura). 17

18 Preparação de material para análise ao microscópio Estufa 60 o C Derreter e eliminar a parafina Preparação de material para análise ao microscópio Xilol Retirada da parafina Série alcoólica - Rehidratação. Hidratação completa 18

19 Preparação de material para análise ao microscópio Coloração Preparação de material para análise ao microscópio Coloração A maioria dos corantes utilizados se comportam como ácido ou base.!estrutura celular basófila, liga-se a corantes básicos.!estrutura celular acidófila, liga-se a corantes ácidos. Corantes básicos: azul-de-tuluidina, azul-de-metileno, hematoxilina... Corantes ácidos: eosina, orange G, fucsina ácida... Hematoxilina/Eosina (HE) Coloração freqüentemente utilizada Além destes corantes freqüentemente utilizados, utiliza se também outros tipos de coloração, como a impregnação com sais de prata e ouro. 19

20 Preparação de material para análise ao microscópio Além destas colorações frequentemente utilizadas, outros métodos baseados em reações químicas (citoquímica), imunológicas (imunocitoquímica), entre outras, também podem ser empregados. Preparação de material para análise ao microscópio Montagem das lâminas 20

21 Preparação de material para análise ao microscópio Análise do Material Preparação de material para análise ao microscópio Resultados 21

22 Plano de corte Avanços em Biologia Celular Desenvolvimento do Microscópio Óptico Desenvolvimento Microscópio Eletrônico Desenvolvimento da Biologia Molecular

23 ...outras técnicas que podem ser empregadas na Biologia Celular e Molecular : Radioautografia : Imunocitoquímica : Cromatografia : Eletroforese : Cristalografia e difração de raio-x : Hibridação de ácidos nucléicos Avanços em Biologia Celular e Molecular Cultura de Células e Manipulação de Moléculas Células HeLa (Henrietta Lacks) George Gey, 1951: primeira cultura de células 23

24 Conhecimento da diversidade estrutural celular Organização geral das células Organismos da natureza (visão clássica) Eucariontes: Protozoários, fungos, plantas e animais Procariontes: Bactérias 24

25 Organização geral das células Organismos da natureza (visão moderna) Bactérias Arqueobactérias Eucariontes 25