Técnicas de Biologia Celular e Molecular. Prof a. DSc. Patricia Castelo Branco do Vale

Transcrição

1 Técnicas de Biologia Celular e Molecular Prof a. DSc. Patricia Castelo Branco do Vale

2 Dimensões em Biologia As células podem ser classificadas como: Macroscópicas: visíveis ao olho humano Microscópicas: invisíveis ao olho humano, tendo como fronteira o poder de resolução do olho humano.

3 Unidades de Medida µm (micrômetro) = 10-6 m = 10-3 mm = 0,001 mm (um milésimo de milímetro) nm (nanômetro) = 10-9 m = 10-6 mm = 0, mm (um milionésimo de milímetro) Å (Ångström) = m = 10-7 mm = 0, mm (um décimo milionésimo de milímetro)

4 Conceitos importantes em formação de imagem Poder de ampliação: capacidade de um aparelho aumentar n vezes uma imagem. Poder de resolução: capacidade de um aparelho fornecer imagens distintas de dois pontos distintos. Limite de resolução: distância mínima a que dois pontos podem estar para o aparelho os mostrar individualizados.

5 MICROSCOPIA Ciência que estuda os métodos e as aplicações em que se usa o Microscópio para observação de objetos, com dimensões inferiores ao limite de resolução do olho humano (0,1 mm).

6 Tamanho relativo das células

7 Classificação dos Microscópios em função do número de sistemas de lentes: Microscópio simples ou Lupa apenas possui uma lente ou um sistema de lentes centradas; Microscópio composto possui dois sistemas de lentes centradas, ocular e objectiva, para produzir uma imagem ampliada

8 Classificação dos Microscópios compostos em função do princípio de iluminação que utiliza Fotônico em que o responsável pela transmissão de imagem é um feixe de fotões (luz visível, ultravioleta ou infravermelho). Eletrônico emprega um feixe de electrões para produzir imagens ampliadas.

9 Microscopia Ótica Campo luminoso Campo escuro Eletrônica Transmissão Varredura Contraste de fase Fluorescente

10 Microscopia Óptica Usa a luz visível (radiação eletromagnética com comprimento de onda compreendido entre 400 e 800 nm). Esta é refratada através de lentes de vidro.

11 Microscópio Óptico Luminoso Sinônimos Microscópio comum Microscópio de luz Microscópio fotônico Microscópio de campo claro

12 Partes integrantes de um microscópio Parte mecânica (estativa) Sistema óptico Sistema óptico de observação Sistema óptico de iluminação

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14 Microscopia Eletrônica A radiação empregada é a de feixe de elétrons, sendo ele refratado por meio de lentes eletrônicas. A melhoria do poder resolvente do microscópio eletrônico está diretamente relacionada ao curto comprimento de onda e a uma maior abertura numérica (ângulo formado pelo eixo óptico e os raios mais externos ainda cobertos pela objetiva). Tipos: de transmissão e de varredura.

15 Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET) A imagem do espécime é formada simultaneamente à passagem do feixe de luz através dele.

16 Composição do MET A construção do MET é robusta, a fim de garantir estabilidade mecânica. As bobinas das lentes são usualmente resfriadas por água que circula a sua volta. A imagem é projetada sobre um anteparo de observação recoberto com um material que fluoresce quando irradiado com elétrons, ou sobre uma placa fotográfica. O poder resolvente obtido depende da qualidade do projeto e construção do ME, da natureza do espécime, e ainda do cuidado e experiência do operador. O intervalo de aumento do MET varia de a cerca de X.

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18 Microscópio Eletrônico de Varredura Um feixe de elétrons extremamente estreito é usado para varrer o espécime. O feixe faz com que o próprio espécime emita elétrons. A imagem é construída em seqüência à medida que o espécime é varrido. (MEV)

19 Composição do MEV A coluna e o sistema de alto vácuo são similares no MET e no MEV. Um conjunto de bobinas defletoras faz com que o feixe varra o espécime. A imagem é montada ponto a ponto, linha por linha. As micrografias obtidas têm aspecto tridimensional. A resolução obtida depende do diâmetro da sonda do feixe eletrônico varrendo o espécime, da natureza do espécime e da sua interação com o feixe, da velocidade de varredura e do número de linhas na imagem. Pode ser operado em uma escala ampla de aumentos, desde 10X até X.

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21 MOC Microscópio Óptico Composto MET Microscópio Electrónico de Transmissão

22 Microscópio de Campo Escuro Um anel escuro no condensador bloqueia a maior parte da luz brilhante e ilumina o espécime com luz oblíqua. Apenas raios desviados são captados pela objetiva. Campo claro Campo escuro

23 Configuração do Microscópio de Campo Escuro Objetiva Luz não coletada pela objetiva Luz difratada pela amostra Amostra Condensador Anel de campo escuro

24 Indicações da Microscopia de Campo Escuro Objetos muito pequenos, cuja visualização é difícil sobre um fundo claro. Pode permitir a detecção de estruturas muito menores que o poder de resolução do microscópio. Em combinação com técnica de fluorescência. Exemplos: bactérias, organelas celulares, filamentos de actina; partículas de prata e ouro usadas em técnicas de histoquímica.

25 Microscópio de Contraste de Fase Dotado de um sistema óptico que transforma diferenças de fase dos raios luminosos em diferenças de intensidade. As diversas estruturas celulares têm quantidades diversas de matéria e causam atrasos diferentes na luz que as atravessa. Tipos de contraste de fase 1) Positivo: amostra é mais escura do que o plano de fundo; 2) Negativo: amostra é mais clara do que o plano de fundo.

26 Aplicações da Microscopia de Contraste de Fase Amostras vivas ou fixadas não coradas; Melhorar contraste para visualização de detalhes em amostras coradas (ex.: estriações transversais de músculos) Observação de células cultivadas, cujo crescimento e divisão mitótica podem ser facilmente seguidos sem o emprego de corantes.

27 Configuração do Microscópio de Contraste de Fase Contraste positivo Contraste negativo

28 Imagens de Microscopia de Contraste de Fase Paramécios vistos com contraste positivo (esquerda) e em contraste negativo (direita). Células de Bacillus thuringiensis observadas em contraste de fase positivo

29 Microscópio de Fluorescência Utiliza luz de comprimento de onda curto e de alta energia (normalmente ultravioleta) para excitar substâncias fluorescentes da amostra. A luz vem do microscópio e incide sobre um espelho dicróico, que reflete a luz ultravioleta até o espécime. A objetiva coleta a luz de comprimento de onda fluorescente que foi produzida e forma a imagem.

30 Aplicações da Microscopia de Fluorescência Exibe estruturas e mede eventos fisiológicos e bioquímicos nas células vivas. Contribui para o estudo de uma multiplicidade de produtos químicos fisiologicamente importantes como DNA, cálcio, magnésio, sódio e enzimas. Identifica reações imunológicas, ou seja, reações antígeno-anticorpo (imunofluorescência). Utilizada no estudo de reações enzimáticas, análise de viabilidade celular e de função celular.

31 Técnicas de preparação das células Preparados temporários Exame de células vivas Cultura de células e de tecidos; Cultivo de protozoários e vegetais unicelulares; Esperma; Células vegetais (películas de folhas); Células em atividade e/ou em circulação. Preparados permanentes (lâminas)

32 Preparado temporário

33 Etapas dos preparados permanentes Fixação Evitar a autólise Impedir a atividade e proliferação das bactérias Endurecer as células Aumentar a afinidade das estruturas celulares pelos corantes usados Aumentar o contraste na microscopia eletrônica.

34 Fixação Química Aldeídos Formaldeído Glutaraldeído Mercuriais Óxidos Física Congelamento e dessecação Calor Ar seco Alcoólicos Metanol Etanol

35 Etapas de fixação e desidratação do material para observação ao microscópio óptico

36 Etapas dos preparados permanentes Microtomia Corte dos tecidos em fatias finas para exame no microscópio. Para ser cortado, o fragmento de tecido fixado é protegido por um material que o envolve e nele penetra. Os tecidos são incluídos em parafina ou em resinas plásticas, e cortados em espessuras de 1 a 6 µm. Para os microscópios eletrônicos, os cortes medem 0,02 a 0,1 µm.

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38 Etapas dos preparados permanentes Coloração Corantes básicos (catiônicos) Hematoxilina Azul de toluidina Azul de metileno Corantes ácidos (aniônicos) Eosina Orange G Fucsina ácida

39 Coloração e Montagem Coloração pelo método da hematoxilina/eosina. Montagem permanente com lâmina e lamínula para microscopia óptica

40 Lâminas coradas Biópsia Hepática corada com Hematoxilina-eosina Alga Chlorophyta em preparação corada com azul de Metileno Pequena artéria corada fortemente em vermelho pela fucsina ácida

41 Citoquímica Estuda a localização intracelular das diversas substâncias que compõem as células. Algumas reações produzem nas células uma intensidade de cor proporcional à concentração da substância em estudo. Exemplos Reação de PAS para glicogênio e glicoproteínas. Reação de Feulgen para DNA.

42 Reação de PAS (Periodic Acid Schiff) Oxidação pelo ácido periódico Coloração pelo reativo de Schiff Glicogênio e glicoproteína com coloração vermelha Fígado: PAS sem e com digestão prévia do glicogênio.

43 Reação de Feulgen Hidrólise das bases púricas por solução aquecida de ácido clorídrico Coloração pelo reativo de Schiff DNA com coloração vermelha Célula de raiz de cebola: O DNA é corado de vermelho