Determinação de Natamicina pelos métodos de HPLC/DAD e LC-MS/MS

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1 Página 1 de 6 1 Escopo Determinação do antifúngico natamicina em vinhos e sucos de frutas empregando a técnica de Cromatografia Líquida de Alta Performance (CLAE ou HPLC, em inglês) com detector de arranjo de fotodiodos (DAD diode array detector) e confirmação do analito por Cromatógrafo Líquido acoplado a Espectrômetro de Massas em tandem (LC-MS/MS). 2 Fundamentos Esta técnica baseia-se na separação dos componentes de uma amostra, os quais se distribuem em duas fases, uma estacionária (coluna C18) e outra móvel (eluente) conforme a interação deste com as referidas fases, e que são detectados em comprimentos de onda apropriados através de detector de arranjo de fotodiodos. A natamicina pode ser separada da matriz e quantificada por HPLC/DAD. 3 Reagentes, padrões e materiais 3.1 Reagentes: Ácido acético glacial; Metanol (para HPLC); Água ultrapura (up). 3.2 Padrões: Natamicina [CAS ], padrão analítico, pureza mínima 95%. Solução-mãe: natamicina em metanol (aproximadamente 100 mg L-1). Padrão secundário (PS-NAT-ddmmmaa). 3.3 Materiais: Pipeta graduada de 5 ml; Balão volumétrico de 10mL e 100 ml (calibrado); Proveta 1L Pipeta volumétrica 3mL Vials de 2mL (de preferência, âmbar); Membranas filtrantes (diâmetro: 33mm e poro: 0,45µm). 4 Equipamentos 4.1 Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (HPLC), composto por coluna de guarda e coluna de octadecilsilano, forno de coluna; degaseificador e detector UV/Vis de arranjo de fotodiodos. 4.2 Cromatógrafo Líquido, equipado com bomba quaternária, degaseificador e auto-amostrador; acoplado ao Espectômetro de Massas triplo quadrupolo API Micropipetas 4.4 Balança analítica 5 Precauções analíticas Uso de EPIs. Preparação dos eluentes em capela. Descarte segregado de resíduos dos eluentes. Armazenar as soluções-padrão em geladeira.

2 Página 2 de 6 6 Procedimentos 6.1 Método HPLC/DAD (screening) Condições de Separação: Fase estacionária: C-18 (dimensões: 25cm x 4,6mm; tamanho da partícula: 5µm); Fase móvel: solução aquosa de ácido acético 0,3%:solução metanólica de ácido acético 0,3% (47:53) Condição eluição: isocrática: Vazão: 0,5 ml min -1 Temperatura do forno: 30ºC Volume injetado: 10 µl Detector UV/Vis: 291nm ; 303nm e 318nm Tempos de retenção: 19 a 22min. Tempo da corrida: 30 min Preparação da fase móvel a) Preparar as soluções aquosa e metanólica de ácido acético 0,3% adicionando 3mL do reagente para cada 1L de solução. b) Registrar a marca e o lote do metanol e do ácido acético, e os lotes de água up no formulário anexo A Lote de Análises (Batch). c) Acoplar os frascos dos reagentes nas bombas do cromatógrafo seguindo a ordem: bomba A Solução aquosa de ácido acético 0,3% bomba B Solução metanólica de ácido acético 0,3% d) Seguir a IU LABV/09 para procedimento de purga das bombas antes do início das análises Preparação dos padrões (Solução-mãe e padrão secundário): a) Pesar cerca de 10 mg do padrão de natamicina, transferir para um balão de 100 ml e completar o volume com metanol. b) Registrar a marca e o lote do analito, do metanol e a identificação da(s) matriz(es) no Anexo B Controle da Preparação da Série de Padrões Natamicina (HPLC). c) Verter a solução-mãe em frascos âmbares, rotular de acordo com a IT LABV/19, e armazenar sob refrigeração. Quando a solução-mãe for usada para preparar uma matriz fortificada com natamicina, identificar a solução como MR-NAT. Registrar a concentração da solução e a identificação da matriz no quadro 2 Materiais de Referência do anexo B. Os materiais de referência equivalem a uma amostra de concentração conhecida que auxiliarão na interpretação dos picos dos cromatogramas, bem como, indicará o tempo de retenção esperado. d) Preparar a solução de trabalho de aproximadamente 10 mg L-1, e a partir dessa, fazer a faixa dinâmica linear (FDL) seguindo o Quadro 1 Calibração do Anexo B, pontos em duplicata.

3 Página 3 de Preparação da amostra a) Pré-tratamento: filtração em membrana 0,45 µm. b) Diluição: 100 µl da amostra para 900 µl de água ultra pura c) Registrar no anexo A, a identificação das pipetas e da corrida cromatográfica. d) Efetuar em duplicata as injeções das amostras Análise cromatográfica a) Identificar o método e o batch como Natamicina_ddmêsaa, iniciar a corrida dos pontos da curva analítica e das amostras. Em um lote de aproximadamente 20 amostras (anexo A), deve estar presente ao menos um padrão secundário ou MR-NAT na matriz de interesse. b) No módulo Postrun do software do equipamento pode-se editar os cromatogramas em relação a parâmetros de integração e curva de calibração. A simetria do sinal, pureza, tempo de retenção e eventual presença de interferências devem ser cuidadosamente avaliados antes de realizar a transferência dos dados brutos. c) A transferência dos dados brutos pode ser realizada utilizando o modelo do anexo D do MET LABV/12. Consiste em copiar os dados da janela de resultados para uma planilha eletrônica nova que será salva na pasta LABV\FFA\HPLC\Natamicina, com o nome relativo à data de análise (exemplo: NAT 27mar2012). d) Após a transferência dos dados brutos para a planilha eletrônica, os resultados de determinada amostra são reunidos em seqüência para o cálculo de média e coeficiente de variação, segundo as fórmulas do Anexo D MET LABV/12. Deve-se avaliar os resultados segundo os critérios de controle de qualidade do método. e) Finalmente, o resultado final será transferido para a seção Natamicina da planilha II-Dados do SGA (Anexo B IT LABV/23), ficando disponível para emissão do relatório de análise. O resultado de natamicina será lido no canal de 303nm, servindo os demais canais apenas como confirmatórios.

4 Página 4 de Método LC-MS/MS (confirmatório) Condições de Separação: Fase estacionária: C-18. Dimensões: 150 mm x 2,1 mm, tamanho de partícula de 5µm, precedida de coluna de guarda (4mm x 3mm) de mesmo material de empacotamento. Fase móvel: solução aquosa de ácido acético 0,1% (eluente A):solução metanólica de ácido acético 0,1% (eluente B). Condição eluição: gradiente (concentração inicial de 25% de eluente B mantida até 2,5 minutos, elevada a 80% em 3 minutos e mantida até 8 minutos, retornando a concentração inicial nos próximos 0,5 minutos) Vazão: 0,250 ml min -1 Temperatura do forno: 30ºC Volume injetado: 2 µl Tempos de retenção: min. Tempo da corrida: 12 min. Espectrômetro de massas: íon analítico m/z 666,4; íons produto m/z 503,5 e 485,3. As condições de ionização e de fragmentação estão descritas no RV/LABV/02 complemento Preparação da fase móvel a. Preparar as soluções aquosa e metanólica de ácido acético 0,1% adicionando 200 µl do reagente para cada 200 ml de solução. b. Registrar a identificação do metanol e do ácido acético, e os lotes de água up no formulário anexo D LC-MS/MS Análise confirmatória de natamicina. c. Acoplar os frascos dos reagentes nas bombas do cromatógrafo seguindo a ordem: bomba A Solução aquosa de ácido acético 0,1% bomba B Solução metanólica de ácido acético 0,1% d. Seguir o POP RPM/24 para uso do equipamento Preparação da curva analítica a. Diluir a solução mãe de natamicina (solução de trabalho) de modo que possibilite a preparação de curva analítica na faixa de 1 a 50 µl L -1 (ppb). Nota: A tabela abaixo mostra um exemplo de curva analítica para determinação de natamicina. A solução de trabalho de 100ppb foi preparada com uma alíquota de 50µL da solução mãe em balão de 50mL. Conc.(ppb) Solução trabalho (µl) Água ultra pura (µl) Matriz branca (µl) b. Registrar o preparo da solução de trabalho, o lote da água, a identificação da matriz e das micropipetas utilizadas no anexo D.

5 Página 5 de Preparação da amostra a. Pré-tratamento: filtração em membrana 0,45 µm. b. Diluição: 100µL da amostra para 900 µl de água ultra pura c. Efetuar em duplicata as injeções das amostras Análise cromatográfica e espectrofotométrica a. No método Natamicina do equipamento, iniciar a corrida dos pontos da curva analítica e das amostras. As amostras que apresentarem concentrações acima do limite máximo da faixa dinâmica linear (FDL) do método confirmatório (50ppb), devem ser diluídas e reanalisadas. b. Após a corrida, identificar os arquivos seguindo o modelo Rotina_Julho_12_2013_Curva e Rotina_Julho_12_2013_Amostras. 7 Resultados 7.1 Expressão dos resultados A fórmula de cálculo considera a concentração média obtida das leituras cromatográficas, além do fator de diluição (exemplo: fator = 10 para diluição 1/10): C Natamicina = C fator dil O resultado será expresso como Detectado ou Não detectado. Pode-se também mencionar no relatório o limite inferior de detecção do método utilizado. Natamicina HPLC/DAD LC-MS/MS LD = 0,5 mg L -1 LD =10,0 µg L Controle de Qualidade Os valores encontrados na determinação do padrão secundário serão plotados na Carta de Controle de Natamicina (anexo C), para monitoramento da precisão e observação da estabilidade do analito. A validade da solução mãe é de 6 meses. Havendo algum desvio, deve ser retomada nova corrida cromatográfica, podendo incluir nova preparação da amostra e dos padrões. Natamicina Exatidão (recuperação) CV >80% <15%

6 Página 6 de 6 8 Arquivamento dos registros Os anexos A, B e D são impressos e arquivados na pasta MET LABV/16 Natamicina, disponível junto à documentação do HPLC (pasta de equipamentos); o anexo C está arquivado na pasta R:\DOCS\LABV\FFA\Qualidade\CARTAS DE CONTROLE e as planilhas de resultados ficam gravadas na unidade \\LABV\HPLC\Natamicina\Dados brutos(ano). 9 Referências Venturini, Aline Torres. Natamicina: análise e controle em sucos de uva e vinhos nacionais e importados comercializados no Brasil. Dissertação de Mestrado do Programa de Pós- Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos ICTA/UFRGS. Porto Alegre, f. 10 Anexos Anexo A MET LABV/16/03 - Formulário Lote de Análises (Batch) Natamicina Anexo B MET LABV/16/03 - Formulário Controle da Preparação da Série de Padrões Natamicina (HPLC) Anexo C MET LABV/16/03 Anexo D MET LABV/16/03 11 Alterações - Planilha eletrônica: Carta de Controle (Natamicina) - Formulário LC-MS/MS Análise confirmatória de natamicina Ampliação da faixa de trabalho da curva analítica e inclusão da expressão de resultados pelo método confirmatório de LC-MS/MS. 12 Responsabilidades O Responsável Técnico (RT) do LABV, ou pessoa por ele autorizada, responde pela elaboração, emissão, distribuição de cópias, arquivamento, análise crítica e revisão desta MET, bem como pelo gerenciamento das não-conformidades decorrentes. É de sua responsabilidade assegurar a implementação e o cumprimento deste documento. A UGQ é responsável pela verificação deste método de ensaio. Revisão: Aprovação: Verificação: Aline Torres Venturini - LABV Paulo Gustavo Celso - LABV Eliana Menezes - UGQ Data: 20/08/2013 Data: 21/08/2013 Data: 21/08/2013