Determinação dos Ácidos Benzóico e Sórbico em vinhos, alcoólicos por mistura e bebidas não alcoólicas por HPLC/DAD
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- Renato de Sequeira Schmidt
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1 Página 1 de 5 1 Escopo Determinação simultânea de conservantes (ácido sórbico e ácido benzóico) em vinhos, alcoólicos por mistura e bebidas não alcoólicas, empregando a técnica de Cromatografia Líquida de Alta Performance (CLAE ou HPLC, em inglês). 2 Fundamentos Os ácidos benzóico e sórbico podem ser separados e quantificados por HPLC. Esta técnica baseia-se na separação dos componentes de uma amostra, os quais se distribuem em duas fases, uma estacionária (coluna C18) e outra móvel (eluente) conforme a interação deste com as referidas fases, e que são detectados em comprimentos de onda apropriados através de detector de arranjo de fotodiodos (DAD diode array detector). 3 Reagentes, padrões e materiais 3.1 Reagentes: Acetato de amônio 0,01M; Ácido acético glacial; Etanol P.A.. Metanol (para HPLC); Água ultrapura (up). 3.2 Padrões: Ácido benzóico [CAS ], padrão analítico, pureza mínima 99,5%, de acordo com a NIT DICLA 030; Ácido sórbico [CAS ], padrão analítico, pureza 99.0%, de acordo com a NIT DICLA 030; Padrão secundário de Ácido benzóico [CAS ], p.a., pureza mínima 99,5%. Padrão secundário de Ácido sórbico [CAS ], p.a., pureza 99.0%, Solução-mãe de ácido benzóico e ácido sórbico em solução hidroalcoólica (10-12%). Solução Controle (SC) e Material de Referência (MR). 3.3 Materiais: Béqueres para dissolução dos ácidos sórbico e benzóico; Pipeta graduada de 5 ml; Balão volumétrico de 500 ml (calibrado); Vials de 2mL; Membranas filtrantes (diâmetro: 33mm e poro: 0,45µm). 4 Equipamentos 4.1 Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (CLAE) LABV-089 e acessórios. Composto por coluna de guarda e coluna de octadecilsilano, forno de coluna; degaseificador e detector UV/Vis de arranjo de fotodiodos.
2 Página 2 de Phmetro (IU LABV/02) 4.3 Micropipeta - faixa de 20 a 300 µl (IT LABV/17) 4.4 Micropipeta - faixa de 50 a 1000 µl (IT LABV/17) 5 Precauções analíticas Uso de EPIs. Descarte segregado de resíduos dos eluentes. Armazenar em geladeira os MR, SC e Solução-mãe. 6 Procedimentos 6.1 Condições de Separação: Fase estacionária: C-18 (dimensões: 25cm x 4,6mm; tamanho da partícula: 5µm); Fase móvel: acetato de amônio:metanol:água (30:40:30) ph 4,2±0,1 (ajustado com ácido acético glacial) Condição eluição: isocrática Vazão: 1 ml.min -1 Temperatura do forno: 30ºC Volume injetado: 10 µl Detector UV/Vis: 228nm (BENZÓICO); 235nm (SÓRBICO I) e 256nm (SÓRBICO II) Tempos de retenção: 7 a 9min (benzóico) e 9 a 12min (sórbico). Tempo da corrida: 14 min. 6.2 Preparação da fase móvel a. Preparar a solução de acetato de amônio 0,01M pesando ~1,55g do reagente para 2L de solução; acertar o ph em ~4,2 com ácido acético glacial. Registrar no formulário Preparação de Soluções (Anexo A IT LABV/19). b. Registrar a marca e o lote do metanol, e os lotes de água up e do acetato de amônio no Anexo A Lote de Análises (Batch). c. Acoplar os frascos dos reagentes nas bombas do cromatógrafo seguindo a ordem: bomba A Acetato de amônio 0,01M bomba B Metanol bomba C Água up. d. Seguir a IU LABV/09 para procedimento de purga das bombas antes do início das análises. 6.3 Preparação dos padrões Solução-mãe: a. Pesar em béqueres separadamente cerca de 35mg de ácido benzóico e 45mg de ácido sórbico. b. Dissolver cada padrão em etanol e transferir para um balão volumétrico de 500mL, de forma que a solução final tenha aproximadamente 10-12% de grau alcoólico. c. Preencher o balão com água (esperar ambientar para acertar o menisco). d. Registrar a marca e o lote dos analitos e de etanol no Anexo B.
3 Página 3 de 5 e. Verter a solução-mãe em frasco, preferencialmente âmbar, para facilitar a retirada das alíquotas; rotular de acordo com a IT LABV/19. A solução apresentará concentração de aproximadamente 70mg/L para ácido benzóico e de 90mg/L para ácido sórbico. f. Preparar os vials da faixa dinâmica linear (FDL) seguindo o Quadro 1 Calibração do formulário do Anexo B. Fazer os pontos em duplicata. g. Para os níveis F e G da FDL, aliquotar a partir da série de replicatas do nível D. NOTA: faixa linear estabelecida no Estudo de Validação (REV 01-11) BENZOICO = 0,7 a 33mg/L SORBICO = 0,9 a 40mg/L Solução Controle - SC / Material de Referência MR Em cada folha do Anexo A deve estar presente ao menos uma SC, com analito de marca diferente da solução-mãe, tendo o papel de padrão secundário para verificação da curva de calibração, e um MR (preferencialmente, na matriz de interesse). Portanto, esta etapa é válida para um lote de análise (batch) de, no máximo, 20 amostras. Essas soluções equivalem a uma amostra de concentração conhecida que auxiliarão na interpretação dos picos dos cromatogramas, bem como, indicará o tempo de retenção esperado. A rastreabilidade do preparo das mesmas é registrada no formulário Preparação de Soluções (Anexo A IT LABV/19). 6.4 Preparação da amostra a. Pré-tratamento: desgaseificação e filtração em membrana 0,45 µm. b. Diluição: tomar a alíquota da amostra considerando o tipo de bebida a ser analisada: - Alcoólico por mistura - Fermentado: filtrado doce ou sidra - Não-alcoólico Amostra Eluente 50µL 950 µl - Vinho - Fermentado: vinho de frutas 100µL 900 µl c. Registrar no anexo A os volumes e a identificação das pipetas, além de detalhar a posição da corrida e o arquivo gerado. NOTA: A cada lote de análise (Batch) duplicar a etapa de diluição de ao menos 10% das amostras e de uma SC/MR. d. Efetuar em duplicata as injeções das amostras, em ordem aleatória juntamente com os padrões. A curva de calibração será elaborada posteriormente, no módulo postrun do equipamento.
4 Página 4 de 5 7 Resultados 7.1 Transferência dos resultados No módulo Postrun do software do equipamento pode-se editar os cromatogramas em relação a parâmetros de integração e curva de calibração. A simetria do sinal, pureza, tempo de retenção e eventual presença de interferências devem ser cuidadosamente avaliados antes de realizar a transferência dos dados brutos. A transferência dos dados brutos e a verificação da mesma devem ser registradas no Anexo D. Consiste em copiar os dados da janela de resultados para uma planilha eletrônica nova (segundo modelo do Anexo D), e será salva na pasta LABV\...\HPLC\Conservantes, com o nome relativo à data de análise (exemplo: Cons 01fev2011). 7.2 Processamento dos resultados: Após a transferência dos dados brutos para a planilha eletrônica, os resultados de determinada amostra são reunidos em seqüência para o cálculo de média e coeficiente de variação, segundo as fórmulas do Anexo D. Deve-se avaliar os resultados segundo item 7.4. Finalmente, o resultado final será transferido para a seção Conservantes da planilha II-Dados do SGA (Anexo B IT LABV/23), ficando disponível para emissão do relatório de análise. O resultado de ácido benzóico será lido no canal de 228nm. O resultado do ácido sórbico será lido prioritariamente no canal de 256nm, servindo o canal de 235nm apenas como confirmatório. A fórmula de cálculo considera a concentração média obtida das leituras cromatográficas (em mg/l), transformando-a para mg/100ml (divisor de 10), além do fator de diluição (exemplo: fator = 10 para diluição 1/10; 20 para diluição 1/20): Ácido sórbico / Ácido benzóico (mg/100ml) = C fatordil 7.3 Expressão dos resultados: A concentração dos analitos será expressa em mg/100ml; na presença de valores menores que o limite inferior de quantificação serão expressos como <LIQ, com menção no relatório dos limites abaixo discriminados: Analito Limite de Detecção - LD (mg/100ml) Limite Inferior de Quantificação - LIQ (mg/100ml) Ácido benzóico 0,2 0,7 Ácido sórbico 0,3 0,9 7.4 Controle de Qualidade Os valores encontrados na determinação das SC e MR serão plotados na Carta de Controle Validação de Solução Controle para Conservantes por HPLC (anexo C), para monitoramento da precisão e exatidão. Havendo algum desvio, deve ser retomada nova corrida cromatográfica, podendo incluir nova preparação da amostra e dos padrões. 10
5 Página 5 de 5 Analito Exatidão (recuperação) Precisão (mg/100ml) CV Ácido benzóico >90% 0,95 <5% Ácido sórbico >90% 1,00 <5% 8 Arquivamento dos registros Os anexos A e B são impressos e arquivados na pasta MET LABV/12 Conservantes, disponível junto à documentação do HPLC (pasta de equipamentos); os anexos C está arquivado na pasta R:\DOCS\LABV\FFA\Qualidade\CARTAS DE CONTROLE e os anexos D ficam gravados na unidade \\LABV\HPLC\Conservantes\Dados brutos(ano). 9 Referências OIV, Determination of sorbic, benzoic and salicylic acid content in wine by the use of high-performance liquid chromatography [OIV-MA-AS313-20]. In: Compendium of International Methods of Wine and Must Analysis, International Organisation of Vine and Wine, v.1, Paris, RV LABV/01 [Relatório de Validação]. Determinação simultânea de ácido sórbico e ácido benzóico por HPLC/DAD em bebidas. 10 Anexos Anexo A MET LABV/12/04 - Formulário Lote de Análises (Batch) Anexo B MET LABV/12/04 - Formulário Controle da Preparação da Série de Padrões Conservantes (HPLC) Anexo C MET LABV/12/04 - Planilha eletrônica: Carta de Controle (Conservantes) Anexo D MET LABV/12/04 - Planilha eletrônica: Transferência de dados brutos dos cromatogramas 11 Alterações Alterado o título do documento e adequado o escopo do método conforme RV/LABV/ Responsabilidades O Responsável Técnico (RT) do LABV, ou pessoa por ele autorizada, responde pela elaboração, emissão, distribuição de cópias, arquivamento, análise crítica e revisão desta MET, bem como pelo gerenciamento das não-conformidades decorrentes. É de sua responsabilidade assegurar a implementação e o cumprimento deste documento. A UGQ é responsável pela verificação deste método de ensaio. Revisão: Aprovação: Verificação: Aline Torres Venturini - LABV Paulo Gustavo Celso - LABV Eliana Menezes - UGQ Data: 07/10/2013 Data: 07/10/2013 Data: 08/10/2013
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