Rachel Siqueira de Queiroz Simões, Ph.D

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1 Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro Centro de Ciências Biológicas e da Saúde Casa da Medicina Unidade Gávea Coordenação Central de Extensão EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR Rachel Siqueira de Queiroz Simões, Ph.D rachelsqsimoes@gmail.com rachel.simoes@ioc.fiocruz.br Epidemiologia Molecular 1

2 TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE REPRESENTA O SOMATÓRIO DE TÉCNICAS QUE FORAM SENDO ACUMULADAS NA ÁREA DE GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR VISANDO A OBTENÇÃO DE MOLÉCULAS DE DNA RECOMBINANTE CONSISTE EM UNIR DNAs DE DIFERENTES ORIGENS EM UM VETOR E TRANSFERI-LO PARA UMA CÉLULA HOSPEDEIRA QUE VAI EXPRESSAR NOVAS CARACTERÍSTICAS GENÉTICAS. ELETROFORESE Técnica que consiste na separação de moléculas ou partículas eletricamente carregadas em uma solução sob influência de um campo magnético

3 ELETROFORESE - HISTÓRICO

4 TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE ELETROFORESE 1. SEPARA ÁCIDOS NUCLÉICOS POR TAMANHO MOLECULAR, SENDO QUE OS FRAGMENTOS MENORES MIGRAM MAIS RAPIDAMENTE; 2. OCORRE A MOVIMENTAÇÃO DE MOLÉCULAS SUBMETIDAS AO CAMPO ELÉTRICO; 3. AS SOLUÇÕES-TAMPÕES ESTABILIZAM O PH DO MEIO E PERMITEM O FLUXO DE CORRENTE ELÉTRICA; 4. COMO SUBSTRATOS SÃO USADOS AGAROSE E POLIACRILAMIDA

5 ELETROFORESE

6 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO 1. PRESENÇA DE NUCLEASES NOS BACTERIÓFAGOS: BACTÉRIA RESTRINGE O CRESCIMENTO DO FAGO E PROTEGE SEU DNA METILANDO-O (MODIFICANDO) 3. FENÔMENO CHAMADO RESTRIÇÃO/MODIFICAÇÃO 4. ADVENTO DAS ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO 5. RECONHECEM SEQUÊNCIAS DE 4 a 8 pb

7 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO GÊNERO: PRIMEIRA LETRA MAIÚSCULA ESPÉCIES: AS OUTRAS MINÚSCULAS

8 TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE APLICAÇÃO DA ENZIMA DE RESTRIÇÃO NA OBTENÇÃO DE UM DNA RECOMBINANTE

9 TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE SOUTHERN BLOT 1. DETECÇÃO DE FRAGMENTO DE DNA EM MEMBRANA DE NITROCELULOSE; 2. AS BANDAS DO GEL DE AGAROSE OU POLIACRILAMIDA SÃO TRANSFERIDAS PARA A MEMBRANA POR MEIO DE UM CAMPO ELETROMAGNÉTICO

10 TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE SOUTHERN BLOT :TRANSFERÊNCIA DO GEL PARA A MEMBRANA E VISUALIZAÇÃO

11 TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE NORTHERN BLOTTING PROCESSO ANÁLOGO AO SOUTHERN BLOTTING, MAS ONDE O RNA E NÃO O DNA É TRANSFERIDO DE UM GEL PARA UMA MATRIZ. WESTHERN BLOTTING TÉCNICA SIMILAR AO SOUTHERN BLOTTING E AO NORTHERN BLOTTING, MAS NESSE CASO PROTEÍNAS SÃO TRANSFERIDAS DE UM GEL DE POLIACRILAMIDA PARA UMA MEMBRANA DE NITROCELULOSE.

12 TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE CLONAGEM MOLECULAR CLONAGEM: É O USO DA MANIPULAÇÃO DO DNA PARA PRODUZIR MÚLTIPLAS CÓPIAS DE UM ÚNICO GENE OU FRAGMENTO DE DNA. CONSISTE NO ISOLAMENTO E PROPAGAÇÃO DE MOLÉCULAS DE DNA IDÊNTICAS. CLONE: UMA OU VÁRIAS BACTÉRIAS QUE TENHAM O MESMO FRAGMENTO DE DNA INSERIDO PELA TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE PRIMEIRO: INSERTO + VETOR = DNA RECOMBINANTE (rdna) SEGUNDO: rdna + CÉLULA HOSPEDEIRA = TRANSFORMAÇÃO

13 TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE CLONAGEM MOLECULAR

14 TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE ENGENHARIA GENÉTICA (1970): o DNA recombinante permite isolar um gene específico, com uma característica desejada, e transfere este gene para outro organismo vivo.

15 Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro Centro de Ciências Biológicas e da Saúde Casa da Medicina Unidade Gávea Coordenação Central de Extensão PROTEÔMICA Rachel Siqueira de Queiroz Simões, Ph.D rachelsqsimoes@gmail.com rachel.simoes@ioc.fiocruz.br Proteômica 15

16 PROTEÔMICA Conceito Ferramenta para identificação de antígenos e imunógenos; Identificação, caracterização e quantificação de todas as proteínas envolvidas na biologia celular; Levantamento quantitativo de proteínas/peptídeos em uma amostra para identificar mudanças de interesse Proteômica 16

17 PROTEÔMICA Cada aminoácido é codificado por uma sequência específica de três nucleotídeos no DNA Proteômica 17

18 ALINHAMENTO DE SEQUÊNCIAS Organismos possuem em grande medidas as mesmas proteínas (ortólogas) que derivam de um ancestral; O alinhamento permite a identificação de porções mais importantes (conservadas) da proteína Proteômica 18

19 ABORDAGENS EM PROTEÔMICA PROTEÔMICA DE EXPRESSÃO -Expressão diferencial PROTEÔMICA FUNCIONAL - Interação proteína-proteína; - Vias de sinalização; - Modificação pós-traducional PROTEÔMICA QUANTITATIVA Proteômica 19

20 EVOLUÇÃO MOLECULAR Quanto mais similares as sequências das proteínas dos organismos, mais próximos eles são evolutivamente Proteômica 20

21 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR Análise de DNA PCR Southern blotting Real time PCR Arranjos Análise de proteína ELISA Western blotting Proteômica 21

22 PROTEÔMICA Nomenclatura ÔMICA Proteômica 22

23 PROTEÔMICA Níveis de pesquisa do genoma nos eucariócitos Proteômica 23

24 PROTEÔMICA Fatores que afetam o proteoma da célula (Epigenética) Proteômica 24

25 PROTEÔMICA Vantagens e limitações da proteômica Produto gênico = expressão de proteínas; Genoma sequenciado do organismo investigado. Detecção de fração de ptns sintetizadas x expressão de todos os genes (array); Ptns em múltiplas isoformas: Dificuldade Proteômica 25

26 PROTEÔMICA Conceito Separação e purificação de proteínas Sabendo que as células possuem milhares de proteínas como purificá-las? - Seleção por propriedade (tamanho, carga e ligação) Obter o extrato bruto: correr em cromatografia de coluna - Fase estável: matriz - Fase móvel: solução com tampão Proteômica 26

27 CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA Polímero carregado negativamente: ptns + se ligam ao polímero e demoram mais a serem eluídas da coluna; A afinidade da ptn é definida também pelo ph Proteômica 27

28 CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO DE TAMANHO Grânulos porosos na matriz retém as moléculas menores; Moléculas grandes não entram nos poros e são eluídas primeiro Proteômica 28

29 CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE Adiciona-se a matriz da coluna um tipo de molécula ligante (ATP) Proteômica 29

30 PROTEÔMICA Experimento clásscio de proteômica ELETROFORESE 2 D: - Método para separação e visualização de proteínas (separação por carga e massa) ESPECTROMETRIA DE MASSA - Análise de alta confiabilidade e identificação de proteínas; -Fragmentação de ptns; - Análise de peptídeos Proteômica 30

31 PROTEÔMICA Ponto Isoelétrico (PI) Proteômica 31

32 PROTEÔMICA 2SDS PAGE Gel Primeira dimensão (Separação por ponto isoelétrico) -Gel com gradiante de ph imobilizado; - Corrente elétrica que leva as ptns até o PI. Segunda dimensão (separação por massa) -Tira do gel é colocado em gel SDS - SDS desnatura a ptn e elimina a carga Proteômica 32

33 PROTEÔMICA IONIZAÇÃO IONIZAÇÃO = íons carregados + (proteínas) ou íons carregados (oligonucleotídeos) Método de Ionização: Cromatografia (HPLC) Detecção de íons: detector monitora o íon, amplifica o sinal e transmite para o sistema Proteômica 33

34 PROTEÔMICA Fluxo de trabalho HPLC-ion MS/MS MS1: usado para selecionar de uma fonte primária de íons passando para fragmentação e dissociação/ MS2: Análise dos íons gerados Proteômica 34

35 PROTEÔMICA Fluxo de trabalho HPLC-ion MS/MS Proteômica 35

36 REDE PROTEÔMICA Proteômica 36

37 PROTEÔMICA Metodologias de Ionização Proteômica 37

38 PROTEÔMICA Após a proteômica... Genômica funcional Protein Chip Proteômica 38

39 GENÔMICA Proteômica 39

40 SEQUENCIAMENTO DE DNA Eletroforese capilar e leitura da fluorescência Proteômica 40

41 SEQUENCIAMENTO DE DNA Comparação com banco de dados para verificação de homologia com genes previamente sequenciados Proteômica 41

42 SEQUENCIAMENTO DE GENES EXPRESSOS Documentar a existência de transcritos gênicos: TRANSCRIPTOMA EST - Expression Sequences Tags EST: Etiqueta de sequência expressa -Sequenciamento único de cada cdna, - Extremidade 5`ou 3` ORESTES (ESTs ricas em ORFS) - Sequenciamento único do amplicon Proteômica 42

43 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE GENES Real Time PCR Proteômica 43

44 HIBRIDIZAÇÃO Proteômica 44