Sequenciamento de DNA

Transcrição

1 Sequenciamento de DNA

2 Figure 8-50a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

3 Método de Sanger Reação de síntese de DNA por uma DNA polimerase

4 A incorporação de um dideoxinucleotídeo interrompe a síntese da nova fita

5 Figure 8-50b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

6 Atualmente usamos dideoxinucleotídeos marcados com corantes fluorescentes de diferentes cores. Quando um dideoxinucleotídeo é incorporado, a síntese da fita é interrompida, e a coloração é dada pela última base incorporada

7 94 o C Milhões de cópias de DNA dupla fita a ser sequenciado 5 CGAAGTCGAGCCAGTTAAACGGCCATGGTACCAATGA 3 3 GCTTCAGCTCGGTCAATTTGCCGGTACCATGGTTACT 5 55 o C O primer seleciona a fita 3 GCTTCAGCTCGGTCAATTTGCCGGTACCATGGTTACT 5 5 CGAAG 3 dctp dctp dctp ddctp dgtp datp dttp dgtp datp dttp dgtp datp dttp ddgtp ddatp ddttp 5 CGAAGTC 5 CGAAGTCG 5 CGAAGTCGA 5 CGAAGTCGAG 5 CGAAGTCGAGC 5 CGAAGTCGAGCC 5 CGAAGTCGAGCCA 5 CGAAGTCGAGCCAG 5 CGAAGTCGAGCCAGT 5 CGAAGTCGAGCCAGTT Muitas cópias de cada um desses comprimentos A cor define a base que terminou o seguimento

8 Eletroforese em capilares. Um sistema de detecção a laser identifica a base marcada e envia a informação a um computador

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10 Phred 10: P = 10% Phred 20: P = 1% Phred 56: P = 0,00025% Usualmente o cutoff usado é 20

11 Se tem dois alelos diferentes, algumas das fitas-templates terão um nucleotídeo e as outras um outro distinto na mesma posição

12 Next Generation Sequencing (NGS) Purificação do DNA ou RNA-cDNA Ligação a um substrato Amplificação por PCR para gerar uma representação clonal da molécula original a ser sequenciada Sequenciamento (Polimerase ou ligase) Química para gerar sinais luminosos Registros dos sinais com métodos de detecção ultrasensíveis

13 Aplicações de sequenciamento de próxima geração Deep-Sequencing Novo sequenciamento Resenquenciamento Hi-C ChIP-Seq RNA Seq Montagem Mapeamento Mapeamento Mapeamento Mapeamento Anotação SNPS / INDEL outras variantes Reconstituição 3D Detecção de Sítios de ligação Montagem dos transcritos Detecção de local de splice Quantificação Genoma Cromatina Transcriptoma Filogenia/Evolução/Ecologia Diferenças genéticas individuais Organização genômica Arquitetura genômica 3D Interações entre ácidos Nucléicos e Proteínas Atividade genômica Interações entre ácidos nucléicos e proteínas Abundância de transcritos Vias co-reguladas Clusters genênicos co-regulados

14 Hi-C

15 ChIP-Seq

16 Enriquecimento das amostras com as sequências de interesse: captura Primers específicos para as sequências de interesse são prepardos em microgotas DNA genômico fragmentado associado aos demais reagentes para PCR

17 Captura em fase sólida Microarrays com as sequências de interesse

18 Sondas de RNA com as sequências de interesse marcadas com biotina

19 Enriquecimento por MIPs (molecular Inversion Probes) a) Azul: sequência padrão Coloridos: sequências específicas a serem selecionadas O Espaço é preenchido com DNA polimerase e ligase b) Azul: sequencias complementares a sítios de restrição (coquetel de enzimas) Coloridos: segmentos de DNA digeridos com as enzimas de restrição

20 PET sequencing strategy: modo de envidenciar a ligação entre duas Pared-end tag: PET extremidades de um segmento de DNA Segmento de DNA genômico Tags No sítio de inserção, o vetor tem sítio para uma enzima de restrição que corta à frente do sítio de reconhecimento Ex: EcoP151, que corta 27 pb adiante Meio da molécula de DNA genômico é eliminado As extremidades são ligadas Vector---Tag---Tag--Vector O Vetor é digerido, restando os segmentos de DNA correspondentes à extremidade de um segmento para ser sequenciado

21 Tag Linker Tag Pair-ended sem vetor

22 Análise do princípio de funcionamento de dois sequenciadores de última geração Life Technologies: SOLID Illumina/Solexa

23 SOLID Preparo da amostra - DNA genômico ou cdna Extração do DNA Fragmentação ((300 a 700 pb) Ligação de adaptadores seleção de fragmentos com ambos os adaptadores

24 Amplificação de fragmentos de DNA isolados

25 Sequenciamento

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30 Técnica de sequenciamento: Azul: AA CC GG TT Vermelho: AT CG GC TA Verde: AC CA GT TG Laranja: AG CT GT TG

31 Vermelho: AT CG GC TA Ligação do adaptador com duas bases complementares à template Lavagem dos adaptadores não ligados. Leitura da florescência

32 O Fosfato 5 dos primers que não foram estendidos é retirado. Estes não serão sequenciados. Clivagem do adaptador com remoção do fluoróforo e criação de um 5 P

33 Nova adição de adaptadores, ligação, lavagem, leitura, clivagem. (n ciclos) Remoção da fita sequenciada em algumas posições. Adição de novo primer de sequenciamento, encurtado em uma base.

34 Primeira adição dos 4 probes e ligação do complementar. Complementar foi vermelho na primeira vez anteriormente Vermelho: AT CG GC TA Azul: AA CC GG TT segunda, na primeira vez, tem que ser o primeiro na segunda vez.

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39 Illumina/Alexa a) Preparo da amostra: igual ao anterior b) Amplificação das moléculas: em cada uma das extremidades dos segmentos existem sequências complementares aos primers fixados na lâmina Bridge amplification

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42 Leitura 1 Leitura 2 Leitura 3 Leitura 4 Leitura 5 Leitura 6

43 M. Nowrousian, 2010