HEMOCENTRO RP TÉCNICA FENOTIPAGEM ERITROCITÁRIA. 1. OBJETIVO Determinar os antígenos e fenótipos eritrocitários em doadores de sangue e pacientes.

Transcrição

1 P. 1/6 1. OBJETIVO Determinar os antígenos e fenótipos eritrocitários em doadores de sangue e pacientes. 2. AMOSTRA Sangue total com anticoagulante EDTA. 3. REAGENTES Antisoros específicos para a fenotipagem a ser realizada (anti-k, -k, -Kp a, -Kp b, -Fy a, -Fy b, -Jk a, -Jk b -M, -N, -S, -s, -Le a, -Le b, -P 1, - Lua, -Di a ). *13 *9 Diluent 2 (BioRad). *9 *13 Cartões LISS/COOMBS. *13 Solução Fisiológica. *13 Hemácias heterozigotas para os antígenos correspondentes. *13 4. EQUIPAMENTOS / MATERIAIS Centrífuga (gel centrifugação). Incubadora. Pipetas Pasteur plástica. Pipetas automáticas. Tubos de poliestireno. *9 Estante. Geladeira. Microplaca. *1 Agitador para microplaca. *1 Centrífuga. *1 Ponteiras. *1 5. *9 5.1 Fenotipagem em gel com soro puro (anti-k, -k, -Kp a, -Kp b, -Fy a, -Fy b, -Jk a, -Jk b, -S, -s, -Di a ) Diluição das Hemácias: As hemácias devem ser ressuspensas em diluente 2 a 1% utilizando-se 10ul de concentrado de hemácias e 1000ul de diluente 2 em um tubo 12x75mm. Técnica: 1. Ressuspender as hemácias em diluente 2 a 1%. 2. Colocar em cada microtubo previamente identificado do cartão LISS/COOMBS, 50ul de hemácias 1% e 25ul do antisoro puro. 3. Incubar o cartão preenchido à 37 0 C durante 15 minutos. 4. Centrifugar. 5. Ler a aglutinação visual segurando o cartão na vertical através dos padrões de aglutinação do gel teste. Registrar os resultados.

2 P. 2/6 5.2 Fenotipagem em gel com cartões anti - Jk ª Diluição das hemácias: Colocar 0,5 ml de diluente 1 e um tubo limpo. Adicionar 50μl de sangue total ou 25μl de concentrado de hemácias. Procedimento: Identificar o cartão. Transferir 10μl da suspensão de hemácias para o cartão. Centrifugar. Ler e registrar os resultados. 5.3 Fenotipagem em tubo - meio salino (anti-m, -N, -Le a, -Le b, -P 1, -K, -Jk a, -Jk b ) *3 *6 *9 Identificar um tubo e colocar uma gota de hemácia do paciente e/ou doador. Lavar 3 vezes com solução fisiológica. Preparar uma suspensão das hemácias a 3 a 5%. *9 Em um tubo previamente identificado, adicionar uma gota da suspensão de hemácias e uma gota do antisoro desejado. Incubar conforme tabela abaixo. Centrifugar conforme validação da centrífuga. Ler. *6 *7 *8 *9 *12 *13 SORO TEMPO (minutos) TEMPERATURA ( C) Anti-M - FRESENIUS 30 4 Anti-M - FRESENIUS - monoclonal 10 TA Anti-M - BIORAD 5 TA *2 Anti-M - GAMMA 15 TA Anti-M - LORNE 15 4 Anti-N - FRESENIUS - monoclonal LI TA Lectina Anti-N - FRESENIUS 10 TA Anti-N - BIORAD 5 TA Anti-N - GAMMA 15 TA Anti-N - LORNE Anti-Le a - FRESENIUS 15 2 a 8 *4 Anti-Le a - GAMMA 5 a 10 TA Anti-Le a - BIORAD LI TA Anti-Le a - LORNE 15 TA Anti-Le b - FRESENIUS 15 2 a 8 *4 Anti-Le b - GAMMA 5 a 10 TA Anti-Le b BIORAD LI TA Anti-Le b - LORNE 15 TA Anti-P 1 - GAMMA 5 TA Anti-P1 - BIORAD LI TA Anti-P1 - LORNE 15 4 Anti-P1 - FRESENIUS - monoclonal 5 TA e 2 a 8 Anti-Jk a - BIORAD 15 TA *3 Anti-Jk a - FRESENIUS - monoclonal LI TA Anti-Jk b - FRESENIUS - monoclonal LI TA Anti-Jk b -BIORAD - monoclonal 15 TA Anti-K - BIORAD 5 TA *2 Anti-K - GAMMA - monoclonal 2 a 10 TA *4 Anti-K - LORNE - monoclonal LI e 15 TA

3 P. 3/6 Obs. 1 Para o soro anti-p1 monoclonal de procedência FRESENIUS, em caso de reação negativa após a leitura a T.A. incubar 5 minutos de 2 a 8 ºC. *13 Obs. 2 Para o soro Anti-K monoclonal de procedência LORNE, em caso de reação negativa após a leitura imediata a T.A. incubar 15 a T.A. * Fenotipagem em tubo-soros reativos pelo teste da Antiglobulina Indireto (anti-k, -k, -Kp a, -Kp b, -Fy a, -Fy b, -Jk a, -Jk b, -Lu a, -Lu b, -Js a, -Js b, -S, -s, -Di a ) *9 Identificar um tubo e colocar uma gota de hemácia do paciente e/ou doador. Lavar 3 vezes com solução fisiológica. Preparar uma suspensão das hemácias de 3 a 5%. *9 Em um tubo previamente identificado, adicionar uma gota da suspensão de hemácias e uma gota do anti soro desejado. *13 Incubar conforme tabela abaixo. Decorrida a incubação, lavar as hemácias 3 vezes com solução salina. Decantar o sobrenadante da última lavagem e secar a borda do tubo com gaze ou papel absorvente. Adicionar a cada tubo 2 gotas de Antiglobulina Humana. *8 Centrifugar conforme a validação da centrífuga e ler. *8 *9 *13 SORO TEMPO (minutos) TEMPERATURA ( C) Anti-K - FRESENIUS - monoclonal Anti-K - GAMMA 15 a Anti-k - FRESENIUS - monoclonal Anti-k - GAMMA 15 a Anti-k - LORNE Anti-Jk a - LORNE Anti-Jk a FRESENIUS 16 a Anti-Jk a FRESENIUS - policlonal Anti-Jk a - GAMMA 15 a Anti-Jk b - LORNE Anti-Jk b - FRESENIUS 15 a Anti-Jk b FRESENIUS - policlonal Anti-Jk b - GAMMA 15 a Anti-Fy a - FRESENIUS - monoclonal Anti-Fy a - LORNE monoclonal Anti-Fy a - GAMMA 15 a Anti-Fy a - FRESENIUS - policlonal Anti-Fy b - FRESENIUS 15 a Anti-Fy b - LORNE policlonal Anti-Fy b - GAMMA 15 a Anti-Fy b FRESENIUS - policlonal Anti-S - GAMMA 15 a Anti-S - DIAMED Anti-S - FRESENIUS - monoclonal Anti-S - FRESENIUS - policlonal Anti - S - LORNE - monoclonal Anti-s - FRESENIUS - monoclonal Anti-s - FRESENIUS - policlonal 15 37

4 P. 4/6 SORO TEMPO (minutos) TEMPERATURA ( C) Anti-s - GAMMA 15 a Anti-s - LORNE- monoclonal Anti-Kp a - LORNE Anti-Kp a - FRESENIUS - policlonal Anti-Kp a - FRESENIUS 15 a Anti-Kp a - GAMMA 15 a Anti-Kp b - LORNE Anti-Kp b - GAMMA 15 a Anti-Kp b FRESENIUS 15 a Anti-Kp b FRESENIUS - policlonal Anti-Di a - FRESENIUS - policlonal Anti-Di a - GAMMA 15 a Anti-Lu a - FRESENIUS - policlonal Anti-Lu a - LORNE Anti-Lu b - FRESENIUS - policlonal Anti-K - FRESENIUS - policlonal Anti- k - FRESENIUS - policlonal Anti-Js a - FRESENIUS - policlonal Anti-Js b - FRESENIUS - policlonal Fenotipagem em microplaca meio salino (anti-m e anti-n) *1 - Identificar um tubo para cada amostra a ser fenotipada. - Preparar uma suspensão de 3 a 5% das hemácias a serem fenotipadas. *9 - Em uma microplaca, previamente identificada, adicionar 25 μ l do anti-soro de fenotipagem. - Pipetar 25 μ l da suspensão de hemácias. - Incubar conforme tabela abaixo. *9 - Centrifugar. - Agitar por 1 minuto. - Realizar a leitura. *2 *13 SORO TEMPO (minutos) TEMPERATURA ( C) Anti-M - GAMMA 15 TA Anti-N - GAMMA 15 TA Anti-M - BIORAD 5 TA 5.6 Fenotipagem em microplaca meio salino com soro puro (anti-k) *3 *9 Técnica: Colocar na microplaca fundo em U previamente identificada 25ul do antisoro puro. *9 Preparar uma suspensão de 3 a 5% das hemácias a serem fenotipadas. *9 Adicionar 25ul das suspensões de hemácias na microplaca. É importante manter a proporção soro/ hemácias (V/V). Incubar a microplaca preenchida de acordo com a tabela abaixo. *9 Centrifugar de acordo com a validação da centrífuga. Agitar em agitador de microplacas durante 60 segundos em velocidade padronizada (1000 rpm). Ler a aglutinação visual utilizando-se um fundo branco.

5 P. 5/6 *8 *13 SORO TEMPO (minutos) TEMPERATURA ( C) Anti-K - BIORAD 5 TA Anti-K - LORNE 15 TA Anti-K - GAMMA - monoclonal 10 TA 6. CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO Técnica em Gel A presença de hemácias aglutinadas retidas no gel indica uma reação positiva, ou seja, presença da expressão do antígeno em questão, enquanto que a ausência de aglutinação com as hemácias depositadas no fundo do microtubo indica uma reação negativa que corresponde à ausência de expressão do antígeno. Técnica em Tubo A presença de hemácias aglutinadas indica uma reação positiva, ou seja, presença da expressão do antígeno em questão, enquanto que a ausência de aglutinação indica uma reação negativa que corresponde à ausência de expressão do antígeno. Técnica em Microplaca *1 A presença de hemácias aglutinadas indica uma reação positiva, ou seja, presença da expressão do antígeno em questão, enquanto que a ausência de aglutinação indica uma reação negativa que corresponde à ausência de expressão do antígeno. Obs.1: Sempre que uma fenotipagem for realizada deverá ser incluído um controle positivo com hemácia heterozigota para o antígeno pesquisado e um controle negativo. Para realização do controle negativo em casos de fenotipagem para antígeno de alta frequência este será realizado se disponível hemácia antígeno negativo. *8 *10 *13 Obs.2: Sempre que, ao avaliar os resultados de fenotipagem, for encontrado um fenótipo com resultado positivo em todos os soros da mesma amostra que reagem até fase de AGH, deverá ser realizado um TAD. Os resultados serão considerados válidos se o resultado do TAD for negativo. O resultado do TAD deverá ser registrado na Planilha de Resultado de Fenotipagem (Anexo I do POIH 022). *11 Em casos de fenotipagem negativa para antígenos antitéticos ( Ex. Jka e Jkb negativos), repetir a técnica para confirmação do sangue raro. *13 Obs.3: Para hemácias com TAD positivo proceder conforme POIH 026.

6 P. 6/6 Aprovação Gerente do Laboratório de Imuno-Hematologia Data / / Diretor Responsável Data / / Implementação Gestão da Qualidade Data / /