Fagocitose LABORATÓRIO 1. Suspensão de antígenos: hemácea de galinha + hemácea de carneiro (HG e HC) a 0,5%

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1 LABORATÓRIO 1 Fagocitose Suspensão de antígenos: hemácea de galinha + hemácea de carneiro (HG e HC) a 0,5% 1. Injetar 1 ml de suspensão de HG + HC a 0,5% via intraperitoneal em um camundongo. 2. Esperar 30 minutos e sacrificar o animal. 3. Injetar 3 ml de salina i.p., massagear o abdômen, abrir um pequeno orifício no peritônio, e manter a parede aberta suspensa com o auxílio de uma pinça (dente de rato), cuidando para não perder a suspensão injetada. 4. Recolher o lavado peritoneal, com auxílio de uma seringa (sem agulha), e colocar a suspensão de células em um tubo de vidro. 5. Colocar uma gota (0,5-1 ml) da suspensão de células em uma lâmina de vidro, e incubá-la a 37o C por 20 minutos. 6. Lavar, suavemente, as lâminas com suspensão salina pré-aquecida para remover as células não aderentes. 7. Observar as lâminas ao microscópio e interpretar os resultados obtidos.

2 LABORATÓRIO 2 Reações de precipitação em meio líquido Grupos 1 e 2 Precipitação em interfase (PROVA DO ANEL) 1. Identificar 2 tubos como soro controle e soro secundário anti-bsa e adicionar 0,5 ml dos respectivos soros nos tubos (sem diluição). 2. Cuidadosamente e sem agitar, adicionar sobre os soros 0,5 ml de BSA com 20 mg/ml. Derramar a solução cuidadosamente pela parede dos tubos de maneira a formar uma tênue interface. 3. Observar o tempo de aparecimento de um precipitado em anel entre as duas soluções. Precipitação em tubo capilar. 1. Utilizando um tubo de micro-hematócrito, absorver por capilaridade aproximadamente 2 cm lineares da solução de BSA 20mg/mL. 2. No mesmo tubo absorver 2 cm lineares de soro controle (sem diluição). Fechar uma das extremidades, selando com massa plástica ou pelo calor. Conservar o tubo em posição vertical. Observar a formação de um precipitado na interfase, em poucos minutos. CERTIFICAR-SE QUE O TUBO NÃO TENHA MARCAS DE DEDOS! 3. Repetir os procedimentos dos itens 1 e 2 usando soro secundário anti- BSA. Grupo 3 Precipitação em tubo 1. Diluição da BSA: a) Identificar 10 tubos de ensaio como BSA de 1 a 10. b) Colocar 4 ml de salina (PBS Phosphate Buffer Saline) nos tubos de 2 a 10. c) Acrescentar 3mL de BSA 20mg/mL (2%) nos tubos 1 e 2 e homogeneizar a solução do tubo 2. d) Transferir 3 ml do tubo 2 para o tubo 3 e homogeneizar. e) Transferir 3 ml do tubo 3 para o tubo 4 e homogeneizar. Repetir até o 10 tubo, homogeneizar e descartar 3mL do tubo 10. OBS: Calcular as concentrações correspondentes de BSA em cada tubo. 2. Identificar tubos numerando-os sequencialmente de 1 a Diluir o soro anti-bsa 1:8 e adicionar 2mL deste soro em cada tubo. 4. Adicionar 1 ml da solução de BSA do tubo 1 do item 1c no tubo 1 e homogeneizar. 5. Fazer o mesmo, respectivamente, para cada um dos outros tubos (tubos 2 a 10). 6. Incubar os tubos à 37 C por minutos, observar e anotar os resultados.

3 LABORATÓRIO 3 Reações de precipitação por difusão radial de Mancini e precipitação com dupla difusão em dupla dimensão de Ouchterlony. MANCINI (Grupo 1) 1. Cobrir duas lâminas para microscópio com 2 ml de ágar-ágar a 1% e deixá-las secar na estufa à 56 C (item previamente realizado). 2. Preparar diluições duplas crescentes de albumina sérica bovina (BSA) em 5 tubos de ensaio, de maneira que se obtenham concentrações de 20; 10; 5; 2,5 e 1,25 mg/ml do primeiro ao quinto tubo. 3. Marcar um tubo de ensaio como soro e mantê-lo em banho-maria à 56 C. 4. Adicionar 1 ml de soro anti-bsa ao tubo soro e 7 ml de ágar para imunodifusão líquido (diluição do soro de 1:8). Homogeneizar o conteúdo do tubo. 5. Cobrir cada lâmina com 5mL de ágar do item 4 e deixar solidificar. Fazer 8 orifícios de aproximadamente 5 mm de diâmetro conforme o modelo abaixo. 6. Identificar as lâminas, produzindo pequenos cortes no agar do canto da lâminas (anotar identificação no protocolo). 7. Preencher (aprox. 50 L) os orifícios 1 a 5 com as diluições duplas crescentes de BSA e os orifícios 6 à 8 com as concentrações desconhecidas. 8. Guardar as placas em câmara úmida por 48 horas a 4 C e anotar os resultados observados. 9. Fazer um gráfico do diâmetro dos anéis formados nos orifícios 1 à 5 contra o logaritmo das concentrações de BSA nos orifícios. Estime a concentração de BSA nos orifícios 6, 7 e 8 por intercalação no gráfico. OBS.: para o gráfico utilize o diâmetro em milímetros ao quadrado. II. OUCHTERLONY (Grupo 2) 1. Colocar 2 a 3 ml de ágar-ágar 1% em uma lâmina de microscópio e deixar secar na estufa. Isto serve como base de fixação do ágar para imunodifusão (item previamente realizado). 2. Colocar +/- 5 ml de ágar líquido para imunodifusão na lâmina de microscópio nivelada. Após a solidificação, perfurar o agar. Fazer 5 orifícios de mais ou menos 5 mm de diâmetro conforme o modelo abaixo. 3. Identificar as lâminas, produzindo pequenos cortes no agar do canto da lâminas (anotar identificação no protocolo).

4 4. Pipetar, nos orifícios, os volumes e soluções, conforme descrito abaixo (o líquido deve atingir a borda dos orifícios, sem transbordar): a) no orifício 1: 25 l uma solução BSA (20 mg/ml); b) no orifício 2: 75 l soro anti-bsa; c) no orifício 3: 50 l uma solução BSA (20 mg/ml); d) no orifício 4: 50 l soro anti-bsa; e) no orifício 5: 25 l uma solução BSA (20 mg/ml); 5. Para evitar dessecação do ágar, tampar as placas e guardar em câmara úmida a 4 C. 6. Verificar a presença de linhas de precipitação após 48 horas. Analisar as precipitações. II. OUCHTERLONY (Grupo 3) 1. Colocar 2 a 3 ml de ágar-ágar 1% em uma lâmina de microscópio e deixar secar na estufa. Isto serve como base de fixação do ágar para imunodifusão (item previamente realizado). 2. Colocar +/- 5 ml de ágar líquido para imunodifusão em uma lâmina de microscópio nivelada. Após solidificar, perfurar o ágar utilizando uma roseta de perfuração. Identificar a orientação da lâmina produzindo cortes na extremidade do agar. Identificar cada orifício da roseta de 1 a 5. OBS.: a roseta forma seis orifícios em disposição circular que devem estar equidistantes 3 mm entre si e 2 mm do orifício central. 3. Pipetar para os orifícios das rosetas no ágar +/- 25µl de líquido conforme segue (o líquido deve atingir a borda dos orifícios, sem transbordar): a) no orifício 1 da roseta uma solução de albumina bovina à 0,1% (1 mg/ml); b) no orifício 2 uma solução de BSA (20 mg/ml); c) no orifício 3, uma solução de soro bovino a 10%; d) no orifício 4, uma solução de soro suíno a 10%; e) no orifício 5, uma solução de soro ovino a 10%; f) colocar no orifício central da roseta o soro anti-bsa 4. Para evitar dessecação do agar, guardar a lâmina em câmara úmida a 4 C. Verificar a presença de linhas de precipitação após 48 horas. Analisar o resultado.

5 LABORATÓRIO 4 Imunoeletroforese com Albumina e Soro Bovino. 1. Utilizar duas lâminas de vidro para microscópio. Cobrir com 2 ml de ágar-ágar à 1% e deixar secar em estufa à 56 C (previamente realizado). Após, colocar as lâminas em local nivelado, cobrir com 4 a 5 ml de ágar para imunoeletroforese fundido e esperar que o gel solidifique. 2. Cortar o ágar segundo o modelo. O ágar dos poços circulares deve ser retirado antes da eletroforese e o ágar da canalete central, só após a eletroforese Preencher o orifício superior com soro bovino e o orifício inferior com albumina bovina 1% (10 mg/ml), diluídos em tampão de eletroforese. Utilizar micropipetas. 4. Identificar as lâminas, produzindo pequenos cortes no agar do canto da lâminas (anotar identificação no protocolo: anti-sb e anti-bsa). 5. Preencher os compartimentos da cuba de eletroforese com o respectivo tampão. 6. Colocar a lâmina no suporte apropriado da cuba de eletroforese. Conectar os extremos da lâmina com o tampão da cuba, fazendo uma ponte de papel filtro umedecidos no tampão. Colocar uma gota de solução saturada de azul de bromofenol no orifício inferior. 7. Cobrir a cuba e conectar na corrente elétrica. Não ultrapasse 7,5 ma ou 35 V por lâmina. CUIDADO: PERIGO DE CHOQUE ELÉTRICO. NÃO TOCAR NO TAMPÃO. 8. SEM TOCAR, acompanhar a migração até que o corante chegue perto da fita de papel filtro do ÂNODO. Neste ponto, desligar o aparelho. 9. Retirar as lâminas da cuba e remover o canalete central das mesmas. Preencher o canalete central das lâminas: uma com soro anti-sb e outra com soro anti-bsa. 10.Colocar as lâminas em câmara úmida e incubar no refrigerador por 48 horas. 11.Verificar a presença de linhas de precipitação após 48 horas. Analisar o resultado.

6 LABORATÓRIO 5 Aglutinação em látex Os soros foram inativados por incubação em banho-maria à 56 C por 30 minutos. 1. Preparação dos soros: a) Colocar nos poços 2 a 12 das linhas A e B 25 µl de PBS 7,2. b) Colocar nos poços 1 e 2 da linha A 25 µl de soro anti-bsa. c) Colocar nos poços 1 e 2 da linha B 25 µl de soro controle d) Homogeneizar e transferir, da coluna 2 para a coluna 3, 25 µl dos soros diluídos anti-bsa. Repetir até as colunas 12. e) Homogeneizar e transferir, da coluna 2 para a coluna 3, 25 µl dos soros diluídos controle. Repetir até as colunas 12. f) Desprezar 25 µl das colunas Adicionar 25 µl de látex adsorvidas com BSA em todos os poços. Agitar suavemente. 3. Cobrir a placa e incubar por 30 minutos à temperatura ambiente, em local livre de vibrações. 4. Observar os resultados em uma lupa, com fundo escuro

7 LABORATÓRIO 6 "Dot blot" 1. Pipetar uma gota de soros de diferentes espécies (aprox. 2 ul) na membrana de nitrocelulose: (item previamente realizado) 2. Secar as membranas (item previamente realizado). 3. Bloquear as membranas por 20 minutos em 3 ml de PBS leite em pó desnatado 5% (BLOTTO 5%). 4. Incubar as membranas por 45 minutos com 3 ml de conjugado Peroxidase-IgG-ovelha anti IgG-bovino diluído 1:5000 em BLOTTO 5%. 5. Lavar a membrana com PBS, 2 vezes, por 5 minutos. 6. Revelar a reação com solução cromogênica (5 mg DAB, 150 L H 2 O 2 em 30 ml de PBS). Cuidado DAB é carcinogênico e H 2 O 2 queima. 7. Parar a reação com água destilada. 8. Observar os resultados.

8 LABORATÓRIO 7 ELISA 1. Sensibilizar uma placa de ELISA com 15 g IgG bovina/poço em Tampão Carbonato/Bicarbonato 50mM ph 9,6 (soro bovino diluído 1 L em 100 L de volume final). Incubar overnight (16 18 h) à 4ºC. (Já realizado) 2. Lavar a placa 3 vezes,1 min cada lavagem, com 100 L/poço de Blotto 5%. 3. Bloquear com 200 L de Blotto 5%. Incubar por 15 min à 37ºC. 4. Colocar 100 L/poço de conjugado Peroxidase IgG-ovelha anti IgG-bovino diluído em Blotto 5%. Incubar por 30 min à 37ºC. Diluição 1:1.000 Diluição 1: Lavar a placa 3 vezes,2,5 min cada lavagem, com 100 L/poço de PBS. 6. Revelar com 100 L da solução cromogênica: 3,4 mg OPD + 10 ml Tampão Fosfato/Citrato + 5 L H2O2 (30%). Colocar em câmara escura por min. 7. Parar a reação com 50 L de H2SO4 (12,5 %). 8. Fazer a leitura da absorbância na leitora de microplaca no filtro para comprimento de onda de luz de 492 nm.

9 LABORATÓRIO 8 Western Blot (WB) Este teste pode ser utilizado para caracterizar antígenos protéicos ou verificar a presença de anticorpos contra antígenos específicos. O WB é geralmente utilizado como teste confirmatório. Etapas 1. Uma amostra protéica é submetida a uma eletroforese em gel de poliacrilamida, no qual as proteínas são separadas conforme sua massa molecular. 2. Após, as proteínas presentes no gel são eletroforeticamente transferidas para uma membrana de nitrocelulose. 3. O procedimento a seguir é semelhante ao visto para dot-blot. O substrato ativado pela enzima precipita junto ao local da ligação do conjugado, permitindo a identificação do peso molecular dos antígenos reconhecidos pelos anticorpos, quando comparados ao marcador de massa molecular.

10 LABORATÓRIO 9 Citometria de Fluxo Citometria de Fluxo é análise multiparamétrica de partículas (geralmente células), uma a uma, em suspensão. As partículas (células) devem ser marcadas com uma ou mais substâncias fluorescentes (fluorocromos), geralmente associadas a anticorpos, que permitam diferenciar grupos/tipos de células. As partículas (células) marcadas em suspensão, de uma forma alinhada, passam por um feixe de luz. A interação das partículas com o feixe de luz gera sinais eletrônicos que são captados por detectores apropriados que informam a dispersão do feixe de luz e/ou a luz emitida pelos fluorocromos após excitação pelo feixe de luz. Suspensão de células Laser Dispersão laser Célula

11 laser Sensor Detectores de Fluorescências célula