BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL

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1 Departamento de Bioquímica Instituto de Química USP Apostila de protocolos Parte A BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL QBQ 036N 05 Professores Carlos T. Hotta Ronaldo B. Quaggio Esta apostila foi desenvolvida originalmente por: Bayardo B. Torres Iolanda M, Cuccovia Maria Têresa Machini Miranda Pedro Soares de Araújo Remo Trigoni Jr. Sandro R. Marana

2 Resumo dos dados obtidos nas práticas Equação da reta do Reagente de Bradford/proteína (P3) Diluição ideal do lisado (P) Protocolo para chegar à diluição ideal do lisado (P) Atividade enzimática do lisado (P) Atividade específica do lisado (P3/P) Curva-padrão do p-nitrofenolato. Curva padrão do p-nitrofenolato. Abs 0 nm y = 0.009x R² = p-nitrofenolato (nmol)

3 Prática (P) Lise de células de levedura Objetivos romper células de Saccharomyces cerevisiae. Reagentes Materiais Aparelhos água destilada células de levedura (fase log tardia) etanol (EtOH) banho de gelo pérolas de vidro 0,5 mm ø pipetadores centrífuga estufa freezer 00 mm fluoreto de α-fenilmetilsulfonila pipetas vórtice (PMSF) em EtOH 0 g/l hipoclorito de sódio (água sanitária) tampão fosfato 00 mm ph 7,0 com 5 mm EDTA (tampão de lise) provetas suporte para tubos tubos de centrífuga tubos de ensaio tubos Falcon Procedimento A Lise celular ATENÇÃO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO. As células estão em um tubo de centrífuga com tampa colocar aproximadamente g (peso úmido) de células de leveduras crescidas até a fase logarítmica tardia. Adicionar ml de tampão de lise 3. Ressuspender as células usando um vórtice. Adicionar 0 µl de PMSF (00 mm) em etanol. O PMSF pode ser encontrado na capela. 5. Homogeneizar em vórtice 6. Adicionar à suspensão 8 ml de pérolas de vidro lavadas e secas 7. Agitar ininterruptamente em vórtice durante min (processo de lise) 8. Resfriar em banho de gelo por min 9. Repetir as operações 7 e 8 por mais vezes 0. Centrifugar a suspensão de células + pérolas de vidro a 850 g (g = aceleração da gravidade) por min. Remover cuidadosamente o sobrenadante passando-o para um tubo Falcon limpo e identificado como LISADO ( evitar coletar o material precipitado). Repetir as etapas a por mais vezes, reunindo os sobrenadantes no mesmo tubo LISADO 3. Usando uma proveta, determinar o volume do LISADO. Dividir o lisado em 3 alíquotas de igual volume e transferí-las para tubos Falcon 5. Identificar os tubos com o número do grupo para armazenagem em freezer a 0 o C Procedimento B Lavagem das pérolas de vidro (executado pelas técnicas). Transferir as pérolas de vidro para um erlenmeyer. Adicionar hipoclorito de sódio no erlenmeyer 3. Agitar algumas vezes durante 5 min. Descartar cuidadosamente o hipoclorito de sódio (x) 5. Adicionar água no erlenmeyer 6. Lavar as pérolas 7. Descartar cuidadosamente a água 8. Repetir as etapas 6 a 8 por mais 5 vezes 9. Adicionar etanol no erlenmeyer 0. Colocar o erlenmeyer numa estufa e aguardar a secagem das pérolas 3

4 Prática (P) Dosagem de açúcares redutores Objetivos dosar colorimetricamente açúcares solúveis no lisado de Saccharomyces cerevisiae. Reagentes Materiais Aparelhos água destilada lisado de leveduras (P) 0 g/l DNS 5 mm Glicose tubos de,5 ml cubetas para leitura pipetadores pipetas ponteiras espectrofotômetro vórtice ATENÇÃO! Os procedimentos A e B podem ser feitos simultaneamente! Procedimento A Curva-padrão de açúcar. Em cada tubo, adicionar as quantidades estipuladas de água e glicose, conforme a Tabela. Adicionar a quantidade necessária de reagente de DNS 3. Homogeneizar em vórtex. Colocar os tubos em banho-maria fervente por 0 min 5. Esfriá-los em água corrente 6. Adicionar 800 µl de água destilada, completando o volume para ml totais 7. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços, seguindo a Figura. 8. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 50 nm no leitor de microplacas (as amostras podem ser lidas simultaneamente com as amostras do procedimento B) 9. Completar a Tabela tubos Soluçãopadrão glicose Tabela Água DNS Branco Solução padrão de glicose = 5 mm = 5 mmol/l = 5 µmol/ml Massa molar glicose = 80 g/mol

5 Branco tubos Massa de glicose (mg) Tabela Réplica (A 50 ) Réplica (A 50 ) Réplica 3 (A 50 ) Procedimento B Dosagem de açúcares redutores no lisado obtido. Agitar o lisado suavemente por inversão. Diluí-lo como indicado abaixo OBSERVAÇÃO: para esse procedimento é necessário que o lisado seja diluído. Para isso segue o procedimento para diluição 00x:. Transferir 0, ml do lisado para um tubo de ensaio grande identificado como L0X. Adicionar 0,9 ml de água destilada 3. Homogeneizar em vórtice. Transferir 0, ml do tubo L0x para um tubo de ensaio grande identificado como L50X 5. Adicionar 0,8 ml de água destilada 6. Homogeneizar em vórtice ATENÇÃO! Este diluição também deveráser utilizada na Prática 3! 3. Em cada tubo, adicionar as quantidades estipuladas de água e glicose, conforme a Tabela 3. Adicionar a quantidade necessária de reagente de DNS 5. Homogeneizar em vórtex 6. Colocar os tubos em banho-maria fervente por 0 min 7. Esfriá-los em água corrente 8. Adicionar 800 µl de água destilada, completando o volume para ml totais 9. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços, seguindo a Figura 0. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 50 nm no leitor de microplacas (as amostras podem ser lidas simultaneamente com as amostras do procedimento A) 0. Completar a Tabela Tabela 3 tubos Amostras Água DNS (ml) Lisado L0x L00x

6 tubos Réplica (A 50 ) Lisado L0x L50x Tabela Réplica (A 50 ) Réplica 3 (A 50 ) A Tubo Branco B Tubo Lisado C Tubo 3 L0x D Tubo L50x E Tubo 5 F Tubo 6 G Tubo 7 H Tubo 8 Figura distribuição de amostras da prática na placa de 96-poços 6

7 Prática 3 (P3) Dosagem de proteína Objetivos dosar colorimetricamente proteínas no lisado de Saccharomyces cerevisiae. Reagentes Materiais Aparelhos água destilada albumina 0, g/l lisado de leveduras (P) reagente de Bradford (ácido fosfórico 85%, Coomassie Blue G, metanol) papel de filtro cubetas para leitura pipetadores pipetas ponteiras suporte para tubos tubos de,5 ml espectrofotômetro vórtice ATENÇÃO! Os procedimentos A e B podem ser feitos simultaneamente! Procedimento A Curva-padrão de proteína. Adicionar em cada tubo os volumes de albumina e água estipulados na Tabela 5. Adicionar o reagente de Bradford (garanta que tenha se passado pelo menos 5 min a partir deste ponto antes de medir as amostras no espectrofotômetro) 3. Homogeneizar em vórtice. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços, seguindo a Figura 5. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 595 nm no leitor de microplacas (as amostras podem ser lidas simultaneamente com as amostras do procedimento B) 6. Completar a Tabela 6 tubos Albumina 0, g/l Tabela 5 Água Reagente de Bradford (ml) Branco 0 00,0 0 90,0 0 80, ,0 0 60, , , , , tubos Massa de proteína (mg) Tabela 6 Réplica (A 595 ) Réplica (A 595 ) Réplica 3 (A 595 ) 7

8 Procedimento B Dosagem de proteínas no lisado de Saccharomyces cerevisiae. Adicionar em cada tubo os volumes de água e amostras do lisado diluído (L50x) estipulados na Tabela 7. Adicionar o reagente de Bradford (garanta que tenha se passado pelo menos 5 min a partir deste ponto antes de medir as amostras no espectrofotômetro) 3. Homogeneizar em vórtice. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços, seguindo a Figura 5. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 595 nm no leitor de microplacas (as amostras podem ser lidas simultaneamente com as amostras do procedimento A) 6. Completar a Tabela 8 OBSERVAÇÃO: Caso a absorbância das amostras experimentais esteja fora dos limites das absorbâncias obtidas na curva-padrão, discuta com o professor ou monitor um novo valor de diluição. Tabela 7 tubos L50x Água Reagente de Bradford (ml) A 00 0,0 A 50 50,0 A ,0 A 0 80,0 A A A3 A tubos Réplica (A 595 ) Tabela 8 Réplica (A 595 ) Réplica 3 (A 595 ) A Tubo Branco B Tubo A C Tubo 3 A D Tubo A3 E Tubo 5 A F Tubo 6 G Tubo 7 H Tubo 8 Figura distribuição de amostras da prática 3 na placa de 96-poços 8

9 Prática (P) Determinação da atividade enzimática Objetivos determinar a atividade da α-glicosidase no lisado de Saccharomyces cerevisiae. Reagentes Materiais Aparelhos água destilada lisado de leveduras (P) banho de gelo microplacas de 96 poços banho a 30 o C espectrofotômetro de 8 mm p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc) pipetadores microplacas em água tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) pipetas ponteiras vórtice tampão carbonato-bicarbonato 50 mm suportes para tubos de ensaio (ph,0) tubos de ensaio tubos de,5 ml Procedimento A diluição do lisado de Saccharomyces cerevisiae ATENÇÃO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO Abaixo segue o procedimento sugerido para a diluição da preparação do lisado de Saccharomyces cerevisiae.. Transferir 0,7 ml do lisado de Saccharomyces cerevisiae para um tubo identificado como L0X. Adicionar 6,3 ml de água destilada gelada e homogeneizar suavemente 3. Transferir, ml de L0X para um novo tubo identificado como L50X. Adicionar 5,6 ml de água destilada gelada e homogeneizar suavemente 5. Transferir 0,7 ml de L0X para um novo tubo identificado como L00X 6. Adicionar 6.3 ml de água destilada gelada e homogeneizar suavemente 7. Manter todos os tubos no gelo Procedimento B determinação da atividade da α-glicosidase ATENÇÃO! Este procedimento deve ser feito para cada uma das diferentes diluições do lisado que foram preparadas. Todos estes ensaios podem ser montados simultaneamente, iniciando o procedimento sempre pela adição do substrato. Somente quando todos os tubos já tiverem recebido o substrato deverá ser iniciada a adição das diferentes diluições de lisado.. Preparar os tubos em de gelo. Adicionar em cada tubo os volumes de NPαGlc estipulados na Tabela 9 3. Adicionar em cada tubo o lisado devidamente diluído. Guarde o resto do lisado para a Prática 5. Transferir simultaneamente todos os tubos para o banho a 30 o C 5. Incubar os tubos pelos intervalos de tempos indicados na Tabela 9 (note que é necessário fazer três conjuntos de tubos diferentes, um para cada diluição de lisado), todas reações podem ser feitas simultaneamente 6. Ao remover cada tubo, interromper a reação enzimática adicionando 800 µl de tampão carbonatobicarbonato ph,0 7. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente 8. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços, seguindo a Figura 3 9. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 0 nm no leitor de microplacas 0. Completar as Tabelas 0 a 9

10 tubos 8 mm NPαGlc (ml) Tabela 9 tampão fosfato ph 7,0 (ml) lisado diluído (L0x, L50x ou L00x) (ml) tempo de incubação a 30 o C (min) 0, 0, 0, 5 0, 0, 0, 0 3 0, 0, 0, 5 0, 0, 0, tubos réplica tubos réplica tubos réplica Tabela 0 L0x Tabela L50x Tabela L00x réplica réplica réplica A L0x tubo L0x tubo L0x tubo 3 L0x tubo B L50x tubo L50x tubo L50x tubo 3 L50x tubo C L00x tubo L00x tubo L00x tubo 3 L00x tubo D E F G H Figura 3 distribuição de amostras da prática na placa de 96-poços 0

11 Prática 5 (P5) Caracterização da enzima ph ótimo Objetivos Determinar o efeito do ph na atividade catalítica da α-glicosidase. Reagentes Materiais Aparelhos água destilada lisado de leveduras (P) banho de gelo microplacas de 96 poços banho a 30 o C espectrofotômetro de 8 mm p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc) pipetadores microplacas em água tampão borato 00 mm (ph 8,0) tampão borato 00 mm (ph 9,0) tampão citrato 00 mm (ph,0) tampão citrato 00 mm (ph 5,0) tampão citrato 00 mm (ph 6,0) tampão carbonato-bicarbonato 50 mm (ph,0) pipetas ponteiras suportes para tubos de ensaio tubos de ensaio tubos de,5 ml vórtice Procedimento A Ensaio da atividade enzimática. Utilize a diluição do lisado que gerou o melhor resultado na Prática anterior, consulte o professor ou o monitor em caso de dúvida.. Realizar os ensaios de atividade enzimática sobre p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc) em 5diferentes valores de ph. As medições feitas na Prática serão consideradas como um sexto valor de ph 3. Preparar em banho de gelo, para todos os tampões diferentes, um conjunto de tubos para os ensaios de atividade de acordo com a Tabela 3 (note que é necessário fazer 5 conjuntos de tubos, cada um utilizando-se tampões de ph diferentes),. Misturar cuidadosamente 5. Adicionar o lisado (devidamente diluído) de Saccharomyces cerevisiae 6. Agitar manualmente com cuidado 7. Transferir todos os tubos do gelo ao mesmo tempo para um banho a 30 o C 8. Incubar os tubos pelos intervalos de tempos indicados na Tabela 3 9. Ao retirar cada tubo do banho, interromper a reação enzimática pela adição de 800 µl de tampão carbonato-bicarbonato 0. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços, seguindo a Figura. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 0 nm no leitor de microplacas. Completar as Tabelas a 8 3. Determinar graficamente o ph ótimo da α-glicosidase

12 Tabela 3 tubos 8 mm NPαGlc (ml) Tampão (ml) lisado diluído (ml) tempo (min) 0, 0, 0, 5 0, 0, 0, 0 3 0, 0, 0, 5 0, 0, 0, 0 Tabela Tabela 5 ph =,0 ph = 5,0 Tubos réplica réplica Tubos réplica réplica 3 3 Tabela 6 Tabela 7 ph = 6,0 ph = 8,0 Tubos réplica réplica Tubos réplica réplica 3 3 Tabela 8 ph = 9,0 Tubos réplica réplica A B C D ph,0 tubo ph,0 tubo ph,0 tubo 3 ph,0 tubo E ph5,0 tubo ph5,0 tubo ph5,0 tubo 3 ph5,0 tubo F ph6,0 tubo ph6,0 tubo ph6,0 tubo 3 ph6,0 tubo G ph8,0 tubo ph8,0 tubo ph8,0 tubo 3 ph8,0 tubo H ph9,0 tubo ph9,0 tubo ph9,0 tubo 3 ph9,0 tubo Figura distribuição de amostras da prática 5 na placa de 96-poços

13 Prática 6 (P6) Caracterização da α glicosidase: Km e Vmax Objetivos Caracterizar a α-glicosidase de Saccharomyces cerevisiae através das determinações da afinidade (K m ) da enzima pelo substrato (p-nitrofenol-α-glicosídeo) e da velocidade máxima (V max ) de hidrólise do substrato. Reagentes Materiais Aparelhos água destilada lisado de levedura,0 mm p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc) em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0),0 mm NPαGlc em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) 8,0 mm NPαGlc em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) tampão carbonato-bicarbonato 50 mm (ph,0) tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) banho de gelo microplacas de 96 poços pipetadores pipetas ponteiras suportes para tubos de ensaio tubos de ensaio banho a 30 o C espectrofotômetro de microplacas vórtice Procedimento A Medidas de velocidade da reação de hidrólise do substrato ATENÇÃO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO. Utilize a diluição usada na Prática 3. O volume total necessário será de 5,0 ml. Adicionar em cada tubo os volumes de NPαGlc estipulados na Tabela 9. ATENÇÃO: prestar atenção nas diferentes concentrações de substrato 3. Preparar os tubos em banho de gelo. Adicionar em cada tubo os volume de tampão e lisado (devidamente diluído) estipulados na Tabela 9. Agitar manualmente com cuidado 5. Transferir todos os tubos do gelo para o banho a 30 o C 6. Incubar todos os tubos por 0 min, se a quantidade de produto da reação começar a saturar, interrompa a reação. Peça ajuda para o professor ou do monitor para tomar esta decisão. Também consulte o professor ou o monitor, se não houver a formação de produto visível após 0 min. 7. Remover todos os tubos do banho 8. Adicionar 800 µl de tampão carbonato-bicarbonato 9. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente 0. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços, seguindo a Figura 5. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 0 nm no leitor de microplacas e completar a Tabela 0. Construir os gráficos necessários para a determinação do K m e V max da α-glicosidase para o substrato utilizado 3

14 tubos mm NPαGlc mm NPαGlc Tabela 9 8 mm NPαGlc Tampão fosfato 00 mm ph 7 Lisado diluído Tabela 0 tubos [S] (µm) réplica réplica A Tubo Tubo Tubo 3 Tubo B Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7 Tubo 8 C Tubo 9 Tubo 0 Tubo D E F G H Figura 5 distribuição de amostras da prática 5 na placa de 96-poços

15 Prática 7 (P7) Caracterização da α glicosidase: determinação de padrão de inibição por maltose Objetivos Determinar o padrão de inibição de maltose sobre a hidrólise de p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc) efetuada pela -glicosidase de Saccharomyces cerevisiae Reagentes Materiais Aparelhos água destilada lisado de levedura,0 mm p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc) em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0),0 mm NPαGlc em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) 8,0 mm NPαGlc em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) 0, M maltose em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0), M maltose em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0),6 M maltose em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) tampão carbonato-bicarbonato 50 mm (ph,0) em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) banho de gelo microplacas de 96 poços pipetadores pipetas ponteiras suportes para tubos de ensaio tubos de ensaio banho a 30 o C espectrofotômetro de microplacas vórtice Procedimento A Medidas da velocidade de reação de hidrólise do substrato na presença de inibidor ATENÇÃO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO. Utilize a diluição usada na Prática 3. O volume total necessário será de 5,0 ml. Adicionar em cada tubo os volumes de NPαGlc e maltose estipulados na Tabela 3 ATENÇÃO: prestar atenção nas diferentes concentrações de substrato e inibidor 3. Agitar manualmente com cuidado.. Transferir todos os tubos do gelo para o banho a 30 o C 5. Incubar todos os tubos pelo dobro do tempo usado na prática 8 6. Remover todos os tubos do banho. 7. Adicionar 800 µl de tampão carbonato-bicarbonato. 8. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente 9. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços 0. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 0 nm no leitor de microplacas e completar a Tabela 33. Construir os gráficos necessários para a determinação do padrão de inibição da α-glicosidase por maltose. 5

16 tubos mm NPαGlc mm NPαGlc 8 mm NPαGlc Tabela 0, M maltose, M maltose Tampão fosfato 00 mm ph 7 Lisado diluído Tabela tubos [S] final (µm) [I] final (mm) réplica réplica A B C D Tubo Tubo Tubo 3 Tubo E Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7 Tubo 8 F Tubo 9 Tubo 0 Tubo Tubo G H Figura 6 distribuição de amostras da prática 7 na placa de 96-poços 6