DNA, RNA e PROTEÍNAS. Carla Costa. Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Serviço e Laboratório de Biologia Celular e Molecular

Transcrição

1 DNA, RNA e PROTEÍNAS Carla Costa Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Serviço e Laboratório de Biologia Celular e Molecular

2 OBSERVAÇÃO

3 DNA A descoberta do DNA foi crucial para o entendimento da biologia ao nível molecular DNA Ácido desoxiribonucleíco é a molécula que contém a informação genética

4 DNA - MARCOS HISTÓRICOS Friedrich Miescher Phoebus Levene Erwin Chargaff Descoberta do DNA (1869) Purinas Identificou os componentes do DNA (1920s) Nucleotídeo T=A G=C Pirimidinas Desoxiribose

5 MARCOS HISTÓRICOS Rosalind Franklin Francis Crick James Watson Difracção DNA por raios-x (1952) Modelo da dupla hélice (1953)

6 ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DO DNA Francis Crick mostra a James Watson o modelo do DNA em dupla hélice

7 DUPLA HÉLICE E ESTRUTURA MOLECULAR DO DNA DNA mede-se em número de pares de bases (bp) 1000 bp = 1 kb bp = 1 Mb 10 nucleótidos numa volta da hélice

8 ESTRUTURA MOLECULAR DO DNA Purinas Pirimidinas

9 DUPLA HÉLICE E ESTRUTURA MOLECULAR DO DNA Cadeias anti-paralelas

10 LOCALIZAÇÃO CELULAR Núcleo: 5-10 μm de diâmetro DNA: 2 m de comprimento DNA+Histonas Nucleossomas Cromatina Cromossomas

11 CROMOSSOMAS NÚCLEO CROMOSSOMAS

12 NÚMERO DE CROMOSSOMAS Organism # of chromosomes DNA (Mb) mug shot Escherichia coli (bacterium) 1 47 Saccharomyces cerevisae (yeast) Caenorhabditis elegans (nematode) 6 97 Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) Drosophila melanogaster (fruit fly) Mus musculus (mouse) 19 + X/Y 3,059 Homo sapiens sapiens (human) 22 + X/Y 3,286

13 ESTRUTURA DO DNA - GENES ESTRUTURA DO DNA Segmento de DNA que codifica para um produto funcional Proteína - Regiões reguladoras - Regiões codificantes (Exões) - Regiões não codificantes (Intrões)

14 LOCALIZAÇÃO CELULAR Núcleo: 5-10 μm de diâmetro DNA: 2 m de comprimento DNA+Histonas Nucleossomas Cromatina Cromossomas

15 CROMATINA E NUCLEOSSOMA NÚCLEO CROMOSSOMAS CROMATINA NUCLEOSSOMA (histonas H1, H2A, H2B, H3, H4) - Nucleossomas: repetições de ~ 200 pb de DNA enrolado à volta de uma região central composta por 8 histonas (H2A, H2B, H3, H4). - Histona H1 junta a estrutura. 10 nm de diâmetro

16 FIBRAS DE CROMATINA Os nucleossomas originam uma fibra de cromatina de ~10 nm de diâmetro. A cromatina pode ser condensada em fibras de 30 nm.

17 EUCROMATINA E HETEROCROMATINA HETEROCROMATINA EUCROMATINA NÚCLEO EM INTERFASE MICROSCOPIA ELECTRÓNICA

18 COMO É QUE UMA SEQUÊNCIA DE DNA CODIFICA PARA UMA PROTEÍNA?? DNA PROTEÍNA DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR Once information has passed into protein, it cannot get out again. ; Francis Crick, 1958

19 DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR Núcleo Citoplasma

20 REPLICAÇÃO, TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO Núcleo Citoplasma

21 MODELOS DE REPLICAÇÃO DO DNA

22 REPLICAÇÃO DO DNA DNA MAKES DNA - INICIAÇÃO - REPLICAÇÃO - TERMINAÇÃO DNA POLIMERASE (5-3 ) PROOFREADING

23 DNA POLIMERASE - EUCARIOTAS Activa em células em divisão e que não estão em divisão função na reparação de danos no DNA Activas em células em divisão Replicação do DNA nuclear

24 REPLICAÇÃO - INICIAÇÃO GARFO DE REPLICAÇÃO - Origem de replicação (ori) sequência particular de DNA onde a replicação é iniciada. - Na ori ligam-se várias proteínas, as cadeias de DNA são abertas, formando a replication bubble. - A replicação inicia-se no garfo de replicação. - A replicação do DNA a partir dos garfos de replicação é bidireccional.

25 REPLICAÇÃO - INICIAÇÃO

26 REPLICAÇÃO - SÍNTESE DA CADEIAS LEADING E LAGGING -Topoisomerases I e II desenrola a dupla hélice de DNA. - Helicase abre a molécula de DNA no topo do garfo de replicação (quebra as ligações por pontes de hidrogénio entre as bases). Síntese 5 -> 3 - Single-Stranded DNA binding proteins (SSB) ligam-se a regiões do DNA em cadeia simples para prevenir a re-ligação em cadeia dupla. - DNA Polimerase inicia a síntese da nova cadeia de forma contínua. - Sintetizada descontinuamente sobre a forma de fragmentos de Okasaki que são pequenas moléculas de DNA (1 a 3kb). -RNA primase sintetiza pequenos fragmentos de RNA. - DNA Polimerase sintetiza os fragmentos de Okazaki.. - DNA ligase liga os fragmentos de Okazaki.

27 FRAGMENTOS DE OKASAKI

28 FRAGMENTOS DE OKAZAKI Primase DNA Pol DNA Polimerase δ RNase H Exonuclease 5-3

29 PROTEÍNAS ACESSÓRIAS DA POLIMERASE

30 PROTEÍNAS ACESSÓRIAS DA POLIMERASE Replication Factor C Proliferating Nuclear Cell Antigen Complexo com a DNA Polimerase Mantem o contacto da Pol com o DNA permitindo a síntese ininterrupta de milhares de pb de DNA

31 PROOFREADING (capacidade de verificação) 1 base em bases incorporadas é adicionada incorrectamente DNA Polimerase δ e ε

32 REPLICAÇÃO - TERMINAÇÃO - Ocorre quando os garfos de replicação se encontram. - DNA Ligase. - Topoisomerase enrola o DNA.

33 MUTAÇÕES NO DNA - ESPONTÂNEAS - INDUZIDAS - RADIAÇÕES - QUÍMICOS

34 MUTAÇÕES ESPONTÂNEAS NO DNA Para além dos erros de incorporação de bases que podem ocorrer durante a replicação. Várias modificações químicas na molécula de DNA podem ocorrer espontâneamente. (perda de purinas) Resultando na quebra da ligação entre as bases puricas e a desoxirribose deixando um local apurinico no DNA.

35 MUTAÇÕES INDUZIDAS POR RADIAÇÕES OU QUÍMICOS A radiação UV induz a formação de dímeros de pirimidina, em que duas timinas adjacentes são unidas por um anel ciclobutano. A formação destes dímeros distorce a estrutura do DNA e bloqueia a transcrição e replicação. adição de grupos alquilo (metil ou etil) a várias posições nas bases de DNA Benzo-apireno reagem com as bases de DNA adicionando grandes grupos químicos à molécula de DNA.

36 MECANISMOS DE REPARAÇÃO DO DNA RADIAÇÕES REPARAÇÃO DIRECTA QUÍMICOS ESPONTÂNEA REPARAÇÃO POR EXCISÃO - EXCISÃO DE BASE - EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEO - REPARAÇÃO MISMATCH

37 REPARAÇÃO DIRECTA DO DNA FOTOREACTIVAÇÃO O processo de reparação dos dímeros de timina designa-se fotoreactivação uma vez que energia proveniente da luz visível é utilizada para quebrar a estrutura de ciclobutano. As pirimidinas originais permanecem na molécula de DNA, agora no seu estado normal.

38 REPARAÇÃO POR EXCISÃO - EXCISÃO DE UMA BASE - EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS - REPARAÇÃO POR MISMATCH

39 EXCISÃO DE UMA BASE O uracilo pode ser erradamente incorporado no DNA em vez da timina durante a replicação ou pode ser formado por desaminação da citosina. A excisão do uracilo é catalizada pela DNA Glicosilase, uma enzima que cliva a ligação entre a base e a desoxiribose, formando-se um local apirimidinico (apurinico se for outro tipo de base a ser removida). O local AP é reparado por uma AP endonuclease que cliva a ligação fosfodiester adjacente e a Desoxiribosefosfodiesterase remove a desoxirribose. O espaço vazio de um nucleotido é preenchido pela DNA Polimerase e estabelecidas as ligações fosfodiéster pela Ligase. Ratinhos mutantes na glicosilase (uracilo) têm elevadas taxas de mutação espontânea e são hipersensíveis a mutações induzidas pelo ácido nitroso (causa desaminação da C para U).

40 REPARAÇÃO POR EXCISÃO - EXCISÃO DE UMA BASE - EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS - REPARAÇÃO POR MISMATCH

41 EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS Mecanismo de reparação em todo o genoma As bases modificadas são removidas como parte de um oligonucleotido contendo a lesão Reconhecimento da base alterada por um complexo contendo a proteína XPC e a hhr23b. A esta interacção segue-se a ligação das proteínas XPB, XPD (são componentes do factor de transcrição TFIIH necessário para o inicio da transcrição) e XPG ao DNA danificado. Actuam como helicase desenrolando 30 pb de DNA à volta do local danificado. A proteína XPA confirma a mutação e recruta a XPF em heterodímero com ERCC1 ao complexo de reparação. As XPF/ERCC1 e XPG são endonucleases que clivam o DNA a 5 e 3 do local danificado. O espaço vazio resultante é preenchido pela DNA Polimerase δ ou ε, em associação com as proteínas RFC e PCNA, e unidos pela Ligase. Genes mutados em doentes com Xeroderma Pigmentosum (XP) sensíveis à radiação UV e devido a deficiências na reparação do DNA, desenvolvem múltiplos cancros de pele.

42 REPARAÇÃO POR EXCISÃO - EXCISÃO DE UMA BASE - EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS - REPARAÇÃO POR MISMATCH

43 REPARAÇÃO POR MISMATCH (MMR) Reconhece bases não emparelhadas que são incorporadas durante a replicação e escapam ao controlo do mecanismo de Proofreading faz um scanning ao DNA replicado de novo. 6 homólogos de MutS e 5 homólogos de MutL, designados por MSH e MLH, respectivamente. Os factores melhor caracterizados em reparação MMR são o MSH2, MSH3 e MSH6. Reparação pós replicativa de erros e é essencial para a manutenção da integridade do genoma.

44 REPARAÇÃO POR MISMATCH (MMR) Incorporação mismatch durante a replicação Excisão Reconhecimento Síntese Mutações em genes MSH e MLH são responsáveis por um tipo de cancro de colon hereditário HNPCC (Hereditary Non Polyposis Colorectal Cancer)

45 DEFEITOS NOS SISTEMAS DE REPARAÇÃO DO DNA

46 REPLICAÇÃO, TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO Núcleo Citoplasma

47 RNA ÁCIDO RIBONUCLEÍCO Estruturalmente semelhante ao DNA contudo: - Ribose em vez de desoxiribose - Uracilo em vez de timina - Moléculas de RNA são mais pequenas - RNA é em cadeia simples

48 TRANSCRIÇÃO - RNA POLIMERASES DE EUCARIOTAS RNA Polimerases II III I III II III Tipos de RNA sintetizados mrna trna rrna 5.8S, 18S, 28S 5S snrna scrna

49 TRANSCRIÇÃO - INICIAÇÃO Citoplasma - ELONGAMENTO - PROCESSAMENTO DO mrna

50 TRANSCRIÇÃO - OVERVIEW

51 TRANSCRIÇÃO DE UMA ÚNICA CADEIA DE DNA 3 5 Cadeia molde Anti-sense 3 RNA Polimerase 5 3 5

52 INICIAÇÃO DA TRANSCRIÇÃO: REGIÃO PROMOTORA REGIÃO PROMOTORA: sequência no DNA onde a RNA Polimerase II inicia a transcrição - TATA box pb upstream do local de inicio de transcrição - INR (Sequência iniciadora) início da transcrição - DPE (Downstream Promotor Element) 30 pb downtream do local de início da transcrição e funciona cooperativamente com o INR

53 TRANSCRIÇÃO - INICIAÇÃO Inúmeras proteínas envolvidas designadas por Factores de Transcrição. -Formação de um complexo de transcrição da RNA polimerase II envolve a ligação do factor TFIID (Transcription Factor II) à TATA Box. TFIID é composto por várias subunidades, incluindo uma TBP (TATA binding protein) e aproximadamente 10 outros polipeptideos designados TBP-associated factors ou TAFs (ligam ao INR ou DPE). - A ligação do TFIID é seguida pelo recrutamento de um segundo factor de transcrição, o TFIIB que serve como ponte para a RNA polimerase II, que se liga ao complexo TBP-TFIIB em associação com outro factor, o TFIIF. - Ao complexo ligam-se mais dois factores, o TFIIE e TFIIH. Helicases XPB e XPD CTD C-terminal domain da Pol II Complexo de iniciação

54 TRANSCRIÇÃO - SEQUÊNCIAS REGULADORAS SEQUÊNCIAS REGULADORAS GC box

55 TRANSCRIÇÃO - ENHANCERS Factores de Transcrição ligam-se à distância a enhancers que interagem com a RNA Polimerase II na região promotora

56 TRANSCRIÇÃO - INICIAÇÃO Inúmeras proteínas envolvidas designadas por Factores de Transcrição. -Formação de um complexo de transcrição da RNA polimerase II envolve a ligação do factor TFIID (Transcription Factor II) à TATA Box. TFIID é composto por várias subunidades, incluindo uma TBP (TATA binding protein) e aproximadamente 10 outros polipeptideos designados TBP-associated factors ou TAFs (ligam ao INR ou DPE). - A ligação do TFIID é seguida pelo recrutamento de um segundo factor de transcrição, o TFIIB que serve como ponte para a RNA polimerase II, que se liga ao complexo TBP-TFIIB em associação com outro factor, o TFIIF. - Ao complexo ligam-se mais dois factores, o TFIIE e TFIIH. Helicases XPB e XPD CTD C-terminal domain da Pol II Complexo de iniciação

57 TRANSCRIÇÃO - INICIAÇÃO Citoplasma - ELONGAMENTO - PROCESSAMENTO DO mrna

58 TRANSCRIÇÃO - ELONGAMENTO ELONGAÇÃO: O mrna vai-se formando ligado ao DNA, na transcription bubble, através da adição de bases (Ex: adenina a uracilo e guanina a citosina) na direcção 5' 3, pela RNA Polimerase II. Pré-mRNA Transcrito primário

59 TRANSCRIÇÃO - INICIAÇÃO Citoplasma - ELONGAMENTO - PROCESSAMENTO DO mrna

60 TRANSCRIÇÃO: PROCESSAMENTO DO mrna O pré-mrna sofre 3 grandes modificações antes de sair do núcleo e ser traduzido em proteína CAPPING - POLIADENILAÇÃO -SPLICING

61 CAPPING, POLIADENILAÇÃO E SPLICING - Eventos que ocorrem coordenadamente com processo de síntese - CTD serve como local de ancoragem para complexos de proteínas envolvidos no processo de processamento do mrna (Poli-A Polimerase)

62 PROCESSAMENTO DO mrna 1) Capping uma metilguanosina é adicionada à extremidade 5' do mrna. Esta modificação é necessária para a estabilização do mrna e para a eficiente iniciação da síntese proteíca. 2) Poliadenilação o mrna é poliadenilado na extremidade 3. Adição de uma cadeia de adeninas que aumenta a estabilidade e o tempo de semi-vida de molécula de mrna. 3) Splicing remoção de intrões (sequências não codificantes) do pré-mrna para formar mrna, contendo somente a estrutura codificante, exões, para serem traduzidos em proteína. Este processo ocorre no spliceossoma.

63 SPLICING - SPLICEOSSOMA Spliceossoma constituído por proteínas e RNAs Small nuclear RNAs (snrnas) Complexados com 6-10 proteínas formando small nuclear ribonucleoprotein particles (snrnps) Compostos por uma única molécula de snrna Complexados formando num único snrnp

64 PROCESSAMENTO DO mrna 1) Capping uma metilguanosina é adicionada à extremidade 5' do mrna. Esta modificação é necessária para a estabilização do mrna e para a eficiente iniciação da síntese proteíca. 2) Poliadenilação o mrna é poliadenilado na extremidade 3. Adição de uma cadeia de adeninas que aumenta a estabilidade e o tempo de semi-vida de molécula de mrna. 3) Splicing remoção de intrões (sequências não codificantes) do pré-mrna para formar mrna, contendo somente a estrutura codificante, exões, para serem traduzidos em proteína. Este processo ocorre no spliceossoma.

65 DO NÚCLEO PARA O CITOPLASMA mrna

66 ENVELOPE NUCLEAR Através do poro nuclear são transportados somente mrna processados Heterocromatina Eucromatina Nucléolo Complexo Poro nuclear

67 TRANSPORTE DO mrna PELO PORO NUCLEAR Localizados na fronteira exão-exão quando o splicing se completa, marcando mrna processado Já no citoplasma o mrna é complexado com novas proteínas Associadas ao mrna atravessam com ele o poro nuclear Heterogeneous nuclear ribonuclear proteins Nuclear signal export estimulam activamente o transporte

68 MICROSCOPIA ELECTRÓNICA TRANSPORTE DO mrna mrna transportado com a extremidade 5 na frente mrna torna-se alongado de modo a facilitar o transporte através da abertura do CPN. mrna associado ao Complexo Poro Nuclear (CPN). Núcleo Citoplasma Quando chegado ao lado citoplasmático os ribossomas ligam-se ao mrna e a síntese proteíca é iniciada. Microscopia electrónica mrna associado a proteínas durante o transporte através do complexo poro nulear (CPN). Barra= 100 nm. Cell 69:

69 MICROSCOPIA ELECTRÓNICA TRANSPORTE DO mrna Vista tangencial no lado citoplasmático do CPN. As setas mostram a passagem de mrna. mrna Microscopia electrónica Transporte do mrna através do complexo poro nulear (CPN) vista do lado citoplasmático. Journal of Molecular Biology, 260: ; Cell 69:

70 TRADUÇÃO PROTEÍNAS - São sintetizadas a partir de mrna - mrna é lido na direcção 5-3 em sequências de 3 nucleotídeos, CODÕES -Amino ácidos (aa) são específicados pelos codões de acordo com o CÓDIGO GENÉTICO

71 CÓDIGO GENÉTICO Sequência de tripletos de nucleotideos, codões, ao longo do mrna e que determinam a sequência de aa numa proteína. 20 aa usados na construção de proteínas, e os codões que codificam para cada aa. O código genético é degenerativo ou redundante 2 ou mais codões codificam para o mesmo aa. Codões degenerativos diferem no terceiro nucleótideo.

72 TRADUÇÃO - A síntese proteíca ocorre nos ribossomas - Envolve interacções entre os vários tipos de moléculas de RNA mrna, trna, rrna

73 MOLÉCULAS ENVOLVIDAS NA TRADUÇÃO A tradução é catalizada por ribossomas que são constituídos por proteínas e rrna. Maquinaria básica para o processo de tradução. A tradução envolve moléculas de trna que liga anti-codões aos codões do mrna. 60S Cada anti-codão está ligado a um aa particular. 40S O ribossoma liga-se ao primeiro codão AUG (codão de iniciação) no mrna. Este codão codifica para o aa metionina (Met).

74 TRADUÇÃO - mrna ligados à subunidade 40S do ribossoma pela extremidade 5 cap - A subunidade do ribossoma faz um scanning do mrna até encontrar um codão de iniciação AUG

75 INICIAÇÃO, ELONGAMENTO E TERMINAÇÃO

76 TRADUÇÃO: INICIAÇÃO - Envolve múltiplas proteínas designadas por eifs (eukaryotic initiation factors) - eif1a e eif3 ligam-se à subunidade ribossomal 40S - eif2 em complexo com GTP, liga-se ao trna iniciador, metionil - mrna é levado para o ribossoma por um grupos de factores eif4 - Ocorre o scanning do mrna até ser encontrado o codão de iniciação AUG - Ocorre a dissociação dos factores de iniciação - A subunidade 60S liga-se à 40S e forma o complexo de iniciação

77 TRADUÇÃO: INICIAÇÃO - A unidade pequena do ribossoma liga-se a um local "upstream" na extremidade 5 do início do mrna. - Prosegue para dowstream (5 ->3 ) até encontrar o codão de iniciação AUG. mrna binding site - Liga-se o anti-codão complementar através do trna iniciador, metionil. - A unidade maior do ribossoma junta-se ao complexo. - O trna iniciador codifica para a metionina (Met). P - Depois da formação do complexo de iniciação a tradução prossegue por elongação da cadeia polipeptídica.

78 TRADUÇÃO: ELONGAMENTO O ribossoma tem 3 locais de ligação para o trna designados por: -P (Peptidil) - A (Aminoacil) - E (Exit) - O trna iniciador liga-se ao local P deixando um local A vazio -O segundo trna liga-se ao local A e forma uma ligação peptídica com o aa inicial -O trna iniciador é translocado para o local E e é libertado. - O ribossoma move-se ao longo do mrna fazendo a ligação de anticodões a codões, adicionando aa à cadeia polipeptídica.

79 TRADUÇÃO: TERMINAÇÃO Quando o ribossoma atinge um codão stop no mrna, o polipeptídeo e o mrna são libertados.

80 DNA - DESCOBERTA FINAL REMARKS - ESTRUTURA MOLECULAR - LOCALIZAÇÃO CELULAR EMPACOTAMENTO HISTONAS NUCLEOSSOMAS CROMATINA (EUCROMATINA E HETEROCROMATINA) CROMOSSOMAS - GENES - DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR - REPLICAÇÃO MODELOS DE REPLICAÇÃO DNA POLIMERASES PROTEÍNAS ACESSÓRIAS DA POLIMERASE INICIAÇÃO SÍNTESE DAS CADEIAS LEADING E LAGGING PROOFREADING TERMINAÇÃO - MUTAÇÕES ESPONTÂNEAS INDUZIDAS RADIAÇÕES QUÍMICOS -MECANISMOS DE REPARAÇÃO DO DNA REPARAÇÃO DIRECTA REPARAÇÃO POR EXCISÃO EXCISÃO DE BASE EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEO REPARAÇÃO MISMATCH -PATOLOGIAS RELACIONADAS COM ATERAÇÕES NOS MECANISMOS DE REPARAÇÃO

81 FINAL REMARKS RNA - RNA POLIMERASES - TRANSCRIÇÃO INICIAÇÃO REGIÃO PROMOTORA SEQUÊNCIAS REGULADORAS ENHANCERS ELONGAMENTO PROCESSAMENTO DO mrna CAPPING POLIADENILAÇÃO SPLICING SPLICEOSSOMA - TRANSPORTE DO mrna DO NÚCLEO PARA O CITOPLASMA - TRADUÇÃO CÓDIGO GENÉTICO INICIAÇÃO ELONGAMENTO TERMINAÇÃO