Engenharia Molecular. Kit Autossômico GEM. EM-22plex sem extração. Manual Técnico

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1 Engenharia Molecular Kit Autossômico GEM EM-22plex sem extração Manual Técnico

2 1. Introdução STRs (short tandem repeats) são sequências repetitivas de 3 a 7 pares de bases encontradas ao longo de todo o genoma humano. Devido ao alto polimorfismo apresentado, esses marcadores têm sido utilizados como método padrão de investigação de vínculo genético, uma vez que apresentam poder de discriminação adequado para a solução da maioria dos problemas de identificação humana. Os marcadores STRs podem ser analisados através da reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando-se primers marcados com fluoróforos. Diferentes locos STRs podem ser analisados simultaneamente através de reações multiplex, na qual vários pares de primers marcados, um para cada loco, são usados na mesma reação. Os alelos são analisados através de eletroforese capilar e podem ser diferenciados entre si tanto pela cor emitida a partir dos fluoróforos ligados aos primers quanto pelos tamanhos dos produtos obtidos. O kit GEM-22plex permite a co-amplificação de 22 locos (21 autossômicos e amelogenina) em um sistema de detecção de cinco cores. Além dos 13 locos que constituem o banco de dados dos Estados Unidos (CODIS), o kit permite a análise de STRs nos locos PentaE, D10S1237, D2S1338, D1S1656, D19S433, HUMF13B, D22S1045 e PentaD (Tabela 1). 1

3 Tabela 1: Descrição dos locos analisados no sistema e dos alelos presentes na Escada Alélica e no DNA genômico controle. DNA Localização no Loco Alelos presentes na Escada Alélica Fluorescência genômico cromossomo controle HUMTPOX 2p23-2per 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 Azul 8,12 HUMVWA 12p12-pter 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 Azul 15,16 D13S317 13q ,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 Azul 11,12 D18S51 18q21.3 8,9,10,11,12,13,13.2,14,14.2,15,15.2,16, 16.2,17,18,19,20,21,22,23,24,25,27 Azul 14,17 Penta E 15q26.2 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17,18,19,20,21,22,23 Azul 5,7 X: p Amelogenina Y: p11.2 X, Y Verde X,Y D5S818 5q ,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 Verde 11,12 D21S11 21q11.2-q ,26,27,28,28.2,29,29.2,30,31.2,32,3 2.2, Verde 29, ,33.2,34,34.2,35,35.2,36,37,38,39 HUMCSF1PO 5q ,7,8,9,10,12,13,14,15 Verde 9,12 D10S q25.3 9,10,11,12,13,15,16,17,18,19,20,21,22,2 3, Verde 20 24,25,26,27 D2S1338 2q ,16,17,18,19,20,22,23,25,26 Verde 17,25 D3S1358 3p ,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 Amarela 16,17 D16S539 16q24-qter 7,8,9,10,11,12,13,14,15 Amarela 9,11 D7S820 7q ,8,9,10,11,12,13,15 Amarela 5,6 15,17,18,19,19.2,20,21,22,23,23.2,24,25 HUMFIBRA_, 4q ,26,27,28,29,30,31,31.2,32.2,43,44, FGA 45, Amarela 22, D1S1656 1q42 11,12,13,14,15,15.2,16,17 Amarela 16,17.3 D8S1179 8q ,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 Vermelha 11,14 D19S433 19q ,10,11,12,12.2,13,13.2,14,14.2,15.2,16, Vermelha 14, ,17,17.2 HUMTH01 11p15.5 4,5,6,7,8,9,9.3,10,11 Vermelha 7,9.3 HUMF13B 1q ,6,7,8,9,10,11,12 Vermelha 6,8 2

4 D22S q ,11,14,15,16,17,18 Vermelha 15,16 Penta D 21q ,3.2,5,7,8,9,10,11,12 Vermelha 9,10 O kit GEM-22plex foi desenvolvido com uma solução tampão que permite a amplificação do DNA a partir de um único disco de sangue ou saliva em papel filtro de 1mm, sem a necessidade de qualquer tipo de extração prévia da amostra. Essa possibilidade resulta em uma redução no tempo de obtenção do resultado e também permite a realização das reações a partir de amostras contendo pouca quantidade de material. 3

5 2. Composição do kit Componentes fornecidos Todos os reagentes necessários para a amplificação e análise dos 22 locos são fornecidos com o kit em uma série de 5 tubos (Tabela 2). Tabela2: Componentes do kit e suas respectivas quantidades para 100 reações. Componente Descrição Volume PCR Mix GEM-22plex Dois tubos contendo MgCl 2, desoxinucleotídeos trifosfatos e Taq DNA 1,0 ml/tubo polimerase em solução tampão para amostras sem extração. Primer Mix GEM-22plex Um tubo contendo primers fluorescentes e não-fluorescentes para 0,11 ml/tubo amplificação de 21 locos STRs + amelogenina. Um tubo contendo DNA genômico controle 2ng/uL de DNA genômico GEM-22plex masculino (Tabela 1). 0,015 ml/tubo Escada Alélica GEM-22plex GEMDYC-512 Um tubo contendo uma mistura de alelos amplificados (ver Fig.2). Marcador de peso molecular para eletroforese capilar. 0,01 ml/tubo 0,06 ml/tubo 4

6 Armazenamento nto dos Componentes GEM-22plex Os fluoróforos ligados aos primers são sensíveis à luz. Portanto, devem ser protegidos quando não estiverem em uso. O armazenamento dos materiais fornecidos deve seguir recomendações específicas (Tabela 3). Tabela 3: Condições de armazenamento dos componentes do kit. Componente PCR Mix GEM-22plex Temperatura de Armazenamento -15ºC a -25ºC Primer Mix GEM-22plex DNA genômico controle GEM- 22plex 2ºC a 8ºC Escada Alélica GEM-22plex GEMDYC ºC a -25ºC 5

7 GEM-22 22plex 3. Equipamentos e materiais necessários Tabela 4 : Equipamentos e materiais necessários que não são fornecidos com o kit. Equipamentos Materiais 1 Termociclador Microtubos 0,2 ml Microcentrífuga Micropipetas Vortex Microtubos 0,5 ml Microtubos 1,5 ml Ponteiras 10 ul e 200 ul 2 Sequenciador HI-DI-Formamida 1 O kit foi otimizado com equipamentos Veriti Applied Biosystem. 2 Recomenda-se a utilização de sequenciador ABI Applied Biosystem. 6

8 4. Reação de PCR Preparo do Master mix Recomenda-se vortexar os tubos por 5 segundos antes do preparo do master mix (Tabela 5). Tabela 5: Volumes necessários para o preparo do Master mix para uma reação. Componente PCR Mix GEM-22plex Primer Mix GEM-22plex Volume 19 ul 1,0 ul Amostra de DNA O kit GEM-22plex foi desenvolvido para ser usado com 1 disco de papel FTA ou papel filtro comum de 1 mm contendo sangue ou saliva. Preparo das reações de PCR Tabela 6: Quantidade de amostra necessária para cada reação de PCR. Controle Controle Componente Amostra negativo positivo Master mix 20 ul 20 ul 20 ul Disco de 1 mm com sangue ou saliva 1 disco DNA genômico controle GEM-22plex ul 7

9 Condições para amplificação GEM-22plex Tabela 7: Condições dos ciclos para a reação de amplificação do sistema. Incubação Desnat. Anelamento Extensão Incubação 95ºC 94ºC 58ºC 72ºC 60ºC 4-10ºC 5 min. 30 seg. 90 seg. 60 seg. 60 min. 1 ciclo 30 ciclos 1 ciclo O tempo da reação pode variar entre os diferentes modelos de termocicladores, porém, estima-se sua conclusão em aproximadamente 3 horas. 8

10 5. Eletroforese das reações em sequenciador ABI 3130 Importante: 1. Antes de injetar as amostras no sequenciador ABI 3130, deve-se realizar a calibração do equipamento utilizando a matrix DS33 (Dye Set G5 - Applied Biosystems) (6-FAM,VIC,NED,PET e LIZ -para mais informações, consulte manual do equipamento). 2. O sistema foi desenvolvido utilizando-se polímero POP7 e capilares de 36cm. Elaboração do protocolo de corrida para eletroforese no sequenciador ABI Abra o software do equipamento e espere o início da tela principal. Em Module Manager, nomeie o protocolo e insira os parâmetros conforme mostrado abaixo. 9

11 2. Em Protocol Manager, insira o nome e os parâmetros adequados. 10

12 Preparo das amostras GEM-22plex 1. Primeiramente, prepare uma mistura contendo 1280 ul de Formamida Hi-Di (Applied Biosystems) e 50 ul de GEMDYC Pipete 12 ul da mistura GEMDYC-512/Formamida Hi-Di em cada poço da placa. * Lembre-se sempre de considerar ao menos um poço da placa para corrida da Escada Alélica. 3. Adicione 1,0 ul das reações ou 1,0 ul da escada alélica GEM-22plex por poço. 4. Sele a placa com a Septa e centrifugue a placa a 3000 r.p.m por 20 segundos. 5. Desnature as amostras por 3 minutos a 95ºC. 6. Incube por 3 minutos a -20ºC. Eletroforese das soluções 1. Clique em Plate Manager e então em New. 11

13 2. Crie a planilha preenchendo os campos necessários. Sample name - insira o nome das amostras; Sample type - selecione sample para as amostras e allelic ladder para a escada alélica. Size Standard - selecione GEMDYC-512. Panel - selecione 22plex_GEM_v1. Analysis Method - HID_Advanced_GEM-22plex. Results Group - crie uma pasta para armazenamento dos arquivos das corridas. Instrument Protocol - HID_36_POP7_G5_GEM-22plex. 3. Clique em OK. 4. Selecione a planilha em Plate view e insira a placa em um dos compartimentos A ou B. 5. Clique em run. 12

14 6. Análise das amostras utilizando o software GeneMapper 3.2 A análise dos resultados obtidos na eletroforese capilar descritas abaixo se referem à versão 3.2 do software GeneMapper. Antes de iniciar, solicite os arquivos de análise pelo carlos@genomic.com.br. Importando o Painel e o arquivo dos Bins 1. Abra o programa GeneMapper v3.2, clique em Tools e posteriormente em Panel Manager. 2. No painel de navegação, clique uma vez em Panel Manager e então selecione File e Import Panels. 3. Na pasta Arquivos_GEM-22plex selecione Megaplex_POP7_Panels_v1.txt e selecione Import. 4. No painel de navegação, clique uma vez em Megaplex_POP7_Panels_v1.txt, selecione File e então Import Bin Set. 5. Na pasta Arquivos_GEM-22plex selecione Megaplex_POP7_Bins_v1.txt e selecione Import. 6. Clique em Apply e então OK. A janela do Panel Manager fechará automaticamente. 13

15 Importando o método de análise HID_Advanced_GEM- 22plex para programa GeneMapper ID 1. Selecione Tools e então GeneMapper Manager. 2. Clique em Analysis Methods. 3. Clique em Import e procure na pasta Arquivos_GEM-22plex o arquivo HID_Advanced_GEM-22plex, selecione e clique em Import. 4. Clique em Done. Importando o padrão de tamanho GEMDYC-512 para programa GeneMapper ID 1. Selecione Tools e então GeneMapper Manager. 2. Clique em Size Standards. 3. Clique em Import e procure na pasta Arquivos_GEM-22plex o arquivo GEMDYC_512, selecione e clique em Import. 4. Clique em Done. Analisando o resultado da eletroforese capilar Para mais detalhes, consulte o tutorial da Applied Biosystems GeneMapper ID Software Human Identification Analysis. 1. Abra o programa GeneMapper v3.2, clique em File e então Add Samples to Project. 14

16 2. Selecione a pasta com os arquivos da eletroforese capilar, clique em Add to list e então Add. 3. Na coluna Sample Type, selecione Ladder, Sample, Positive Control or Negative Control. Todo projeto deve conter no mínimo um Ladder. 4. Na coluna Analysis Method selecione o método de análise HID_Advanced_GEM-22plex. 5. Na coluna Panel, selecione o painel 22plex_GEM_v1 que está dentro da pasta Megaplex_POP7_Panels_v1. 6. Na coluna Size Standard, selecione o padrão de tamanho GEMDYC Clique no botão Analyze. Resultados Um painel representativo de uma reação GEM-22plex feita a partir de 1 disco de papel filtro de 1mm com sangue e o painel da escada alélica são mostrados nas figuras 1 e 2. 15

17 Figura 1: Resultado da eletroforese de 1,0 ul de uma reação feita a partir de um disco de papel filtro de 1mm contendo sangue seguindo os procedimentos descritos para o kit GEM-22plex. 16

18 Figura 2: Resultado da eletroforese de 1,0 ul da mistura de alelos fornecida com o kit GEM-22plex, seguindo os procedimentos descritos anteriormente. 17

19 7. Contato Genomic Engenharia Molecular Rua Itapeva, 500 Conjunto 5AB São Paulo- SP Responsável técnico: Dr. Martin Whittle 18