Eficiência da PCR convencional na detecção de Leishmania spp em sangue, pele e tecidos linfoides

Transcrição

1 Eficiência da PCR convencional na detecção de Leishmania spp em sangue, pele e tecidos linfoides Aluna: Carina de Mattos Soares Orientadora: Dra Cídia Vasconcellos Supervisora: Dra Vânia Lucia Ribeiro da Matta Execução: Laboratório de Patologia e Moléstias Infecciosas (LIM50) Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo)

2 As leishmanioses são doenças causadas pelo protozoário do gênero Leishmania que é transmitido ao hospedeiro através da picada de insetos flebotomíneos Espécie do parasito Leishmaniose cutânea Leishmaniose mucosa Leishmaniose visceral

3 A reação em cadeia da polimerase (PCR) tem sido empregada cada vez mais no diagnóstico das leishmanioses devido à sua alta sensibilidade e especificidade (Reithinger; Dujardin, 2007). Outra possível aplicação da PCR refere-se à identificação da espécie do parasito diretamente na amostra clínica. Importância identificação das espécies: direcionamento do tratamento, prognóstico do paciente PCR: amplificação exponencial

4 OBJETIVO Determinar a eficácia da PCR convencional na detecção de Leishmania no sangue, pele e tecidos linfóides (baço, linfonodo) de animais sabidamente infectados com diferentes espécies do parasita

5 MATERIAIS E MÉTODOS Sangue, pele e tecidos linfóides (baço, linfonodo) de cães naturalmente infectados com Leishmania (L.) infantum chagasi (espécie visceral) (n=8). Sangue e pele de camundongos infectados experimentalmente com Leishmania (L.) amazonensis (n=2), Leishmania (V.) braziliensis (n=1) e Leishmania (V.) shawi (n=2) (espécies cutâneas) Controles-positivo da PCR (cepas referência) Leishmania (Leishmania) infantum chagasi (MHOM/ BR/72/LD46); Leishmania (Leishmania) amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269); Leishmania (Viannia) braziliensis (MHOM/BR/1995/M15280) Leishmania (Viannia) shawi (MCEB/BR/1984/M15789)

6 MATERIAIS E MÉTODOS Para realizar a PCR convencional utilizamos um termociclador Os produtos amplificados foram visualizados no gel de agarose após a realização de uma eletroforese para separação dos fragmentos de DNA amplificados A visualização destes fragmentos foi feita através da exposição do gel à luz ultravioleta Pente Poço Gel Tampão Fonte C U B A 100 V do DNA

7 Primers RV1/RV2 (alvo: kdna) Lima Junior et al. Rev. Soc. Bras. Med. Trop 2009; 42(3): Leish1/Leish2 (alvo: kdna) Francino et al. Vet Parasitol. 2006; 137 (3-4): pb 120 pb Hsp70f /Hsp70r (alvo: gene da proteína de choque térmico de 70 kda) Graça et al. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 2012;107(5): pb

8 RESULTADOS RV1/RV2 PM Lc Lc La Ls Lc Lc Lc Lc Lc Lc La Lb Ls Lc La Lb Ls CN 145 pb PM S S S S B B L L P P P P P CP CP CP CP CN Houve amplificação dos 4 controles positivos (Lc, La, Lb, Ls) provenientes de cultura Houve detecção do DNA de Leishmania apenas nas amostras de cão infectadas com L. (L.) i. chagasi (Lc). Realizamos então a nested-pcr nas amostras negativas para aumentar a chance de detecção do parasito.

9 RESULTADOS RV1/RV2 Nested PCR PM La Ls La Lb Ls Lc La Lb Ls CN 145 pb PM S S P P P CP CP CP CP CN Houve detecção do DNA de La, Lb e Ls nas amostras anteriormente negativas Este par de primers tem sido usado para identificar L. (L.) i. chagasi. Para saber se haveria preferência de amplificação do DNA desta espécie e não exclusividade, realizamos diluição seriada das 4 cepas- controle para determinar a sensibilidade da PCR-RV1/RV2 para cada uma delas.

10 RESULTADOS RV1/RV2 Diluição seriada de L. (L.) i. chagasi PM CN PM CN Diluição seriada de L. (L.) amazonensis PM CN PM CN 3,8 ng/µl 0,23 pg/µl 55,4 ng/µl 0,2 ng/µl

11 RESULTADOS RV1/RV2 Diluição seriada de L. (V.) braziliensis PM CN CN Diluição seriada de L. (V.) shawi PM CN 149,1 ng/µl 0,7 ng/µl 197,4 ng/µl 6,1ng/µL

12 RESULTADOS RV1/RV2 Espécies Concentração picogramas/microlitro Leishmania (L.) i. chagasi 0, 23 Leishmania (L.) amazonensis 216,4 Leishmania (V.) braziliensis 582,4 Leishmania (V.) shawi 6156,2

13 RESULTADOS Leish1/Leish2 PM Lc Lc La Ls Lc Lc Lc Lc Lc Lc La Lb Ls Lc La Lb Ls CN 120 pb PM S S S S B B L L P P P P P CP CP CP CP CN Houve amplificação dos 4 controles positivos (Lc, La, Lb, Ls) provenientes de cultura Houve detecção do DNA de Leishmania apenas nas amostras de cão infectadas com L. (L.) i. chagasi (Lc). Esse para de primer é considerado gênero-específico. Baixa concentração de parasitos nas amostras de camundongos infectados com cepas cutâneas? Realizamos então a nested-pcr nas amostras negativas para aumentar a chance de detecção dos parasitos.

14 RESULTADOS Leish1/Leish2 Nested PCR PM Ls La La Lb Ls Lc La Lb Ls CN 120 pb PM S S P P P CP CP CP CP CN Após a nested-pcr: houve amplificação do DNA de La, Lb, Ls em todas as amostras anteriormente negativas, exceto no sangue de camundongo infectado com Ls, provavelmente devido a muito baixa parasitemia, comum nas leishmanioses

15 RESULTADOS Hsp70f/Hsp70r PM Lc Lc La Ls Lc Lc Lc Lc Lc Lc La Lb Ls Lc La Lb Ls CN 234 pb PM S S S S B B L L P P P P P CP CP CP CP CN Observamos a amplificação do DNA de Leishmania em todas as amostras clínicas testadas, comprovando o caráter gênero-específico desse par de primers.

16 RESULTADOS Hsp70f/Hsp70r Digestão com Hae III PM Lc Lc Lc Lc Lc Lc La Lb Ls Lc La Lb Ls 234 pb 150 pb 125 pb 90 pb 75 pb 65 pb PM B B L L P P P P P CP CP CP CP 65 pb 45 pb 40 pb Após a digestão, verificamos padrões de restrição diferentes e exclusivos capazes de identificar as espécies de Leishmania presentes nas amostras clínicas testadas.

17 PCR RV1/RV2 Amplificou o DNA de diferentes espécies de Leishmania em todas as amostras clínicas Apresentou maior sensibilidade para detecção de L. (L.) i. chagasi PCR Leish1/Leish2 Amplificou o DNA de diferentes espécies de Leishmania em todas as amostras clínicas Amplificou o DNA de diferentes espécies de Leishmania em todas as amostras clínicas PCR Hsp70f/Hsp70r Após digestão com enzima de restrição, permitiu a identificação das espécies de Leishmania nos tecidos analisados

18 CONCLUSÕES A PCR convencional com os 3 diferentes primers mostrou bom desempenho na detecção de Leishmania spp nas diversas amostras testadas (pele, tecidos linfoides, sangue). Mostramos também que, na dependência dos primers utilizados, a PCR pode mostrar maior sensibilidade na detecção de Leishmania (L.) infantum chagasi (RV1/RV2), como permitir também a identificação de espécies com tropismo cutâneo ou visceral (hsp70 foward e reverse).