Diagnóstico Laboratorial de Infecções Virais. Profa. Claudia Vitral

Transcrição

1 Diagnóstico Laboratorial de Infecções Virais Profa. Claudia Vitral

2 Importância do diagnóstico laboratorial virológico Determinar a etiologia e acompanhar o curso de uma infecção viral Avaliar a eficácia do tratamento antiviral Diferenciar viroses com sintomas semelhantes Triagem de infecções virais em bancos de sangue Diagnosticar doenças congênitas Determinar o prognóstico ou a conduta a ser tomada com o paciente Estudos epidemiológicos

3 Ameaça da emergência de infecções virais para a saúde pública Vírus Ebola Vírus Zika Vírus Chikungunya Vírus da febre amarela Vírus MERS - CoV Podem se disseminar rapidamente e estar associadas com complicações graves Importância do diagnóstico laboratorial: Primeira etapa no processo de controle das epidemias Confirmação laboratorial necessária em virtude da similaridade dos aspectos clínicos e epidemiológicos de muitas doenças infecciosas

4 Diagnóstico Laboratorial de Viroses MÉTODOS DIRETOS MÉTODOS INDIRETOS Isolamento viral Detecção de antígenos virais Detecção do genoma viral Pesquisa de anticorpos específicos (sorologia) 4

5 Onde procuramos os vírus ou os anticorpos formados contra eles? 5

6 6

7 Escolha da amostra biológica: Vias de entrada Trato respiratório Aparelho respiratório Nariz e boca Conjuntiva Ferida Aparelho Trato digestivo Artrópode Aparelho Trato urogenital Ânus Pele Pele Capilares

8 Obtenção da amostra apropriada Etapa mais importante do diagnóstico laboratorial : requer o conhecimento da cinética viral nos vários tipos de espécimes com relação ao tempo desde o início dos sintomas Precisa saber não somente o que coletar como quando coletar...

9 Relação entre o estágio da doença e a presença de vírus e o aparecimento de anticorpos específicos Estágio da doença Detecção de vírus Detecção de anticorpos Incubação Raramente Não Pródromo Ocasionalmente Não Fase aguda Frequentemente Frequentemente Recuperação Raramente Habitualmente Convalescência Muito raramente Habitualmente

10 Escolha da amostra biológica para diagnóstico Infecções entéricas FEZES Infecções respiratórias, urogenitais e oculares SECREÇÕES CORPORAIS Qualquer infecção SANGUE Infecções dérmicas TECIDO DA LESÃO Infecções do SNC LIQUOR

11 Secreções corporais Secreção nasal/orofaringe, secreção vaginal, secreção uretral Coleta pela raspagem de superfícies mucosas com swabs

12 Tecidos Obtenção por biópsia ou raspagem de lesões (verrugas, vesículas) Incluídos pela parafina Congelados

13 Fezes e urina 13

14 Sangue e líquidos corporais Coleta de sangue por punção venosa Coleta de líquor por punção lombar

15 ... E como transportar a amostra biológica para diagnóstico laboratorial Lembre-se: Vírus são rapidamente inativados pelo calor Transporte precisa ser refrigerado: Resfriado: tempo de transporte < 24 horas Congelado: tempo de transporte > 24 horas

16 Métodos de diagnóstico laboratorial MÉTODOS DIRETOS Isolamento viral

17 Isolamento viral Sistemas celulares:: Vantagens: alta sensibilidade, método padrão de diagnóstico, permite a detecção de um vírus desconhecido Desvantagens: método lento, alto custo e realização complexa

18 Isolamento viral em cultivo celular Exemplo: Investigação do vírus da poliomielite em um caso de paralisia flácida aguda Amostra biológica

19 Isolamento viral: metodologia 1. Tratamento de amostras biológicas 2. Inoculação em cultura celular em fluxo laminar

20 3. Reconhecimento da replicação viral (efeito citopático) A, Células Vero não infectadas. B, após infecção por poliovírus, mostrando a perda da monocamada

21 3. Confirmação do vírus isolado A confirmação da identidade viral pode ser realizada por testes imunológicos (imunofluorescência, ELISA) ou técnicas moleculares Elisa PCR IF

22 Métodos de diagnóstico laboratorial MÉTODOS DIRETOS Detecção de antígenos virais: Imunofluorescência (IF) Ensaio imunoenzimático (ELISA)

23 Para pesquisar um antígeno é preciso ter... O anticorpo correspondente E como fazemos pra enxergar a reação Ag/Ac? Marcando esse anticorpo

24 IMUNOFLUORÊSCENCIA Exemplo: Diagnóstico de raiva

25 Raiva humana Transmitida principalmente partir de caninos, felinos, macacos (saguis) e quirópteros. O diagnóstico da raiva se baseia na pesquisa do antígeno viral no tecido nervoso de animais com suspeita da raiva, cujo resultado é de fundamental importância para o tratamento profilático humano pós-exposição Método de diagnóstico laboratorial: Imunofluorescência direta

26 Imunofluorescência (IF) 1. Adição da amostra teste (Ag) na lâmina de IF 2. Adição do anticorpo específico marcado 3. Observação da fluorescência no microscópio 26

27 ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO Exemplo: Triagem de portadores do vírus da hepatite B (HBV) em bancos de sangue

28 Hepatite B A triagem de portadores do HBV em bancos de sangue se baseia na pesquisa do antígeno de superfície do HBV (HBsAg) em amostras de soro Método de diagnóstico laboratorial: ELISA direto

29 Ensaio imunoenzimático (ELISA): 1. Adição da amostra teste (Ag) em cavidade de placa contendo o anticorpo específico 2. Adição de anticorpo marcado com uma enzima substrato Ac+ enzima 3. Adição do substrato da enzima em solução cromógena com desenvolvimento de cor amostra 29

30 Métodos de diagnóstico laboratorial MÉTODOS DIRETOS Detecção do genoma viral: Hibridização molecular PCR

31 Hibridização Molecular Exemplo: Diagnóstico da infecção pelo papilomavírus humano (HPV)

32 Papilomavírus O diagnóstico da infecção pelo HPV se baseia na pesquisa do genoma viral em tecido, p.ex., biópsia cervical (tecido parafinizado) Método de diagnóstico laboratorial: Hibridização in situ

33 Para pesquisar uma sequência nucleotídica em células de um tecido é preciso ter... A sequência nucleotídica complementar (sonda) E como fazemos pra enxergar a formação do híbrido? Marcando a sonda (p.ex. enzima)

34 Detecção genoma viral por hibridização molecular

35 Reação em cadeia da polimerase (PCR) Exemplo: Diagnóstico da infecção pelo vírus da hepatite C (HCV)

36 Hepatite C O diagnóstico da infecção pelo HCV se baseia na pesquisa do genoma viral no soro Método de diagnóstico laboratorial: PCR

37 Para amplificar uma sequência nucleotídica é preciso ter... Todos os componentes necessários para fazer o DNA

38 DESNATURAÇÃO T elevada para separar as fitas de DNA HIBRIDIZAÇÃO T diminuída para ligação dos primers ao DNA EXTENSÃO T elevada para DNA polimerase construir a cadeia complementar AMPLIFICAÇÃO EXPONENCIAL Processo é repetido e a região de interesse é amplificada exponencialmente

39 Visualização do fragmento de DNA amplificado (amplicon) em gel de agarose

40 Métodos de diagnóstico laboratorial Pesquisa de anticorpos (sorologia) MÉTODOS INDIRETOS

41 Anticorpos importantes no controle da infecção viral: IgM: marcador de infecção aguda diagnóstico de infecção congênita IgG: imunidade passada resposta vacinal IgA: imunidade de mucosa (trato respiratório, trato gastrointestinal)

42 Pesquisa de anticorpos para fins de diagnóstico viral Pesquisa de IgM Diagnóstico de infecções agudas recentes: mononucleose infecciosa, hepatite A, hepatite B, rubéola, dengue Pesquisa de IgG Investigação de infecção passada: pré-natal (CMV, EBV, rubéola, hepatite B, HIV), resposta vacinal (HBV), ou infecção crônica (HIV, HCV)

43 Só desperta paixão de aprender quem tem paixão de ensinar Paulo Freire