FISIOLOGIA ANIMAL II

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1 DEPARTAMENTO DE ZOOLOGIA FACULDADE DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA UNIVERSIDADE DE COIMBRA FISIOLOGIA ANIMAL II AULAS e 3 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE E LÍPIDOS NO SANGUE POR COLORIMETRIA CAETANA CARVALHO, PAULO SANTOS 006 1

2 INTRODUÇÃO A absorção de luz visível de determinado comprimento de onda pode ser utilizada para a determinação da concentração de uma determinada substância em solução. Quando a substância em estudo não tem esta propriedade, é submetida a reacções enzimáticas que levam à produção dum composto corado. De acordo com a lei de Beer-Lambert, a concentração de uma determinada substância é directamente proporcional à quantidade de luz absorvida pela solução. Contudo, esta lei apenas se aplica se a luz incidente for monocromática, isto é, composta por um único comprimento de onda. O espectrofotómetro, dispositivo utilizado nos laboratórios clínicos e fisiológicos na determinação da concentração de substâncias em solução, possibilita que uma amostra seja irradiada com um determinado comprimento de onda seleccionado pelo operador. Uma determinada fracção da luz incidente é absorvida pela solução e a restante atravessa a amostra, sendo detectada numa célula fotoeléctrica. Esta detecção possibilita a determinação do quociente entre a luz incidente e a luz que atravessa a amostra, obtendo-se assim a absorvência da solução (A). Para a conversão dos valores de absorvência de luz em concentração da amostra é necessário efectuar uma curva de calibração. Esta curva é obtida através da determinação da absorvência de vários padrões com várias concentrações conhecidas da substância em estudo. Com os valores da absorvência e as concentrações das substância de cada padrão constrói-se um gráfico e traça-se uma recta que passa pelos pontos obtidos (regressão linear). A concentração da substância em estudo na amostra obtêm-se através da sua absorvência por extrapolação na curva padrão. A concentração de glicose, colesterol e triglicerídeos no plasma sanguíneo podem ser medidos usando esta técnica colorimétrica. A detecção de concentrações anormais destas substâncias no plasma podem estar associadas a doenças específicas. Assim, os objectivos destas experiências são precisamente a determinação das concentrações de glicose, colesterol total, lipoproteínas de alta densidade (HDL) e triglicerídeos no plasma do sangue de mamíferos e a sua comparação com os valores normais. Será também discutido o possível significado funcional de diferenças encontradas.

3 PARTE PRÁTICA 1 ISOLAMENTO DO PLASMA 1. Recolher o sangue para um tubo contendo EDTA, na proporção de mg para cada ml de sangue. Centrifugar o sangue numa centrífuga de bancada a 4000 rpm durante 5 min 3. Recolher cuidadosamente o sobrenadante (plasma) e centrifugar novamente durante 5 min a 4000 rpm, para eliminar o máximo de glóbulos vermelhos. Determinação da concentração de glicose no plasma A determinação da concentração de glicose no plasma é feita por um método espectrofotométrico que se baseia na quantificação dum composto corado formado a partir da glicose numa reacção enzimática. O plasma é incubado com um reagente obtido comercialmente que contém 4- aminofenazona, fenol, e duas enzimas, a glucose oxidase (GOD) e a peroxidase (POD). Na presença da glicose oxidase, a glicose é oxidada com formação de peróxido de hidrogénio. Este reage com aminofenazona e fenol, numa reacção catalizada pela peroxidase, formando-se um composto corado. A intensidade da cor, determinada pela absorção de luz a determinado comprimento de onda, é directamente proporcional à concentração do composto corado. Glu.oxidase D - glicose + O + + HO D gluconato HO Peroxidase H O aminofenazona + fenol composto quinona + 4HO 1) Material e Reagentes - tubos de ensaio de 15 ml - pipetas de 5 ml - micropipetas automáticas de 00 µl - espectrofotómetro e cuvetes para o espectrofotómetro - plasma - reagente Glu-Cinet 3

4 ) Procedimento experimental 1. Marcar os tubos para a curva padrão de 0 (0 glicose) a 3, e adicionar a cada tubo a solução padrão de D-glicose (1 mg/ml) e H O, conforme indicado na Tabela I. Diluir a amostra de plasma para metade (1:1) com uma solução de NaCl 0,9%. 3. Adicionar aos tubos 4 e 5 das amostras 50 µl do plasma não diluído, e 50 µl do plasma diluído aos tubos 6 e Adicionar a todos os tubos,5 ml do reagente. 5. Agitar os tubos e incubar durante 15 min à temperatura ambiente. 6. Ler a absorção de luz (densidade óptica, DO) a 510 nm e anotar os resultados na Tabela I. 7. Construir a curva padrão que relaciona a DO com a concentração de glicose nos padrões. 8. Determinar a quantidade de glicose nos tubos das amostras por extrapolação na curva padrão. 9. Determinar a concentração de glicose no plasma tendo em conta as diluições efectuadas. Expressar a concentração de glicose em mg por 100 ml de plasma. Tabela I Tubo D-glucose (µl) H O (µl) Reagente (ml) ,5 DO 510 nm Padrões , , ,5 4 (não diluída) ,5 Amostras 5 (não diluída) ,5 6 (diluída) ,5 7 (diluída) ,5 (Nota: O volume a colocar nos tubos 4,5,6 e 7 é de plasma e não do padrão) Glicémia normal (humanos, em jejum): mg/100 ml 4

5 3 Determinação da concentração de colesterol no plasma A determinação da concentração de colesterol no plasma é realizada por um método espectrofotométrico que se baseia na quantificação dum composto corado formado a partir da colesterol através de várias reacções enzimáticas. O plasma é incubado com um reagente obtido comercialmente que contém 4- aminoantipirina, fenol, e três enzimas, a colesterol esterase, a colesterol oxidase e a peroxidase. O colesterol esterificado presente na amostra de plasma é decomposto em colesterol livre e ácidos gordos por acção da colesterol esterase. Tanto o colesterol livre formado nesta reacção como o colesterol livre existente na amostra são depois oxidados por acção da colesterol oxidase, formando-se peróxido de hidrogénio. Este reage com a 4- aminoantiripina e com o fenol, numa reacção catalizada pela peroxidase, formando-se um composto corado. Col. esterase Colesterol esterificado + H O colesterol+ ácidos gordos 1 Col.oxidase Colesterol + O + + HO colesterona HO Peroxidase H O aminoantiripina + fenol quinonaimina + 4HO Para calibrar o método, faz-se também a reacção com concentrações conhecidas de colesterol (padrões). 1) Material e Reagentes - tubos de ensaio de 10 ml - micropipetas automáticas de 10 e de 1000 µl - espectrofotómetro - cuvetes para o espectrofotómetro - plasma - padrão de colesterol (00 mg/100 ml) - Reagente para colesterol ) Procedimento experimental 1. Marcar os tubos para a curva padrão de 0 (0 colesterol) a 3, e adicionar a cada tubo a solução padrão de colesterol (00 mg/100 ml) e H O, conforme indicado na Tabela II.. Adicionar 0 µl da amostra aos tubos respectivos. 5

6 3. Adicionar a todos os tubos ml do reagente. 4. Agitar os tubos e incubar durante 5 min a 37ºC. 5. Ler a absorção de luz (densidade óptica, DO) a 500 nm e anotar os resultados na Tabela II. 6. Construir a curva padrão que relaciona a DO com a concentração de colesterol nos padrões. 7. Determinar a quantidade de colesterol nos tubos das amostras por extrapolação na curva padrão. 8. Determinar a concentração de colesterol no plasma tendo em conta as diluições efectuadas. Expressar a concentração de colesterol em mg por 100 ml de plasma. Tabela II Tubo Colesterol (µl) H O (µl) Reagente (ml) DO 500 nm Padrões Amostras (Nota: O volume a colocar nos tubos 4 e 5 é de plasma e não do padrão) Colesterol normal (humanos, em jejum): < 00 mg/100 ml 6

7 4 Determinação da concentração de HDL no plasma As lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL) e de baixa densidade (LDL) no soro podem ser precipitadas com fosfotungstato e iões magnésio. No sobrenadante ficam contidas as lipoproteínas de alta densidade (HDL). Após esta separação, a determinação da concentração de HDL no plasma é realizada com base no método espectrofotométrico utilizado para a determinação do colesterol total, mediante as reacções abaixo indicadas. Col. esterase Colesterol esterificado + H O colesterol + ácidos gordos 1 Col.oxidase Colesterol + O + + HO colesterona HO Peroxidase H O aminoantiripina + fenol quinonaimina + 4HO Para calibrar o método, faz-se também a reacção com concentrações conhecidas de colesterol (padrões). 1) Material e Reagentes - tubos de micro centrifuga - tubos de ensaio de 10 ml - micropipetas automáticas de 10, 00 e 1000 µl - espectrofotómetro - cuvetes para o espectrofotómetro - plasma - colesterol 40 mg/100 ml - reagente ) Procedimento experimental 1. Pipetar para um tubo de microcentrifuga 00 µl de amostra e 500 µl de reagente B.. Agitar fortemente (vortex), e incubar durante 10 min à temperatura ambiente. 3. Centrifugar durante 10 min a 5000 rpm. 4. Recolher o sobrenadante com cuidado. 7

8 5. Marcar os tubos para a curva padrão de 0 (0 colesterol) a 3, e adicionar a cada tubo a solução padrão de colesterol (40 mg/100 ml) e H O, conforme indicado na Tabela III. 6. Adicionar aos tubos das amostras 00 µl do sobrenadante. 7. Adicionar a todos os tubos ml do reagente. 8. Agitar os tubos e incubar durante 10 min a 37ºC. 9. Ler a absorção de luz (densidade óptica, DO) a 500 nm e anotar os resultados na Tabela III. 10. Construir a curva padrão que relaciona a DO com a concentração de HDL nos padrões. 11. Determinar a quantidade de HDL nos tubos das amostras por extrapolação na curva padrão. 1. Determinar a concentração de HDL no plasma tendo em conta as diluições efectuadas. Expressar a concentração de HDL em mg por 100 ml de plasma. Tubo Colesterol (µl) Tabela III H O (µl) Reagente (ml) DO 500 nm Padrões Amostras (Nota: O volume a colocar nos tubos 4 e 5 é de plasma e não do padrão) HDL normal (humanos, em jejum): >40 mg/ 100 ml 8

9 5 Determinação da concentração de triglicerídeos no plasma A concentração de triglicerídeos no plasma é determinada com base na técnica utilizada na determinação de colesterol. O plasma é incubado com um reagente obtido comercialmente que contém 4-aminoantipirina, fenol, e quatro enzimas, a lipase, a glicerol cinase, a glicerol-3-p oxidase e a peroxidase. Os triglicerídeos presentes na amostra são decompostos em glicerol e ácidos gordos por acção da lipase. O glicerol sofre depois uma fosforilação, por acção da glicerol cinase, passando a glicerol-3-fosfato. Este composto é depois oxidado em dihidroxiacetona-p e peróxido de hidrogénio. Este reage com a 4-aminoantiripina e com o fenol, numa reacção catalizada pela peroxidase, formando-se um composto corado. Lipase Triglicerideos + H O glicerol+ ácidos gordos Glicerol G licerol + ATP cinase Glicerol 3 P + ADP G3P - oxidase Glicerol P + O + Dihidroxiacetona HO Peroxidase H O aminoantiripina + fenol quinonaimina + 4HO Para calibrar o método, faz-se também a reacção com concentrações conhecidas de colesterol (padrões). 1) Material e Reagentes - tubos de ensaio de 10 ml - micropipetas automáticas de 10, 00 e 1000 µl - espectrofotómetro - cuvetes para o espectrofotómetro - plasma - glicerol 00 mg/100 ml - reagente ) Procedimento experimental 1. Marcar os tubos para a curva padrão de 0 (0 triglicerídeos) a 3, e adicionar a cada tubo a solução padrão de glicerol (00 mg/100 ml) e H O, conforme indicado na Tabela IV.. Adicionar 0 µl de amostra aos tubos respectivos 9

10 3. Adicionar a todos os tubos ml do reagente. 4. Agitar violentamente (vortex), e incubar durante 5 min a 37ºC. 5. Ler a absorção de luz (densidade óptica, DO) a 500 nm e anotar os resultados na Tabela IV. 6. Construir a curva padrão que relaciona a DO com a concentração de glicerol nos padrões. 7. Determinar a quantidade de triglicerídeos nos tubos das amostras por extrapolação na curva padrão. 8. Determinar a concentração de triglicerídeos no plasma tendo em conta as diluições efectuadas. Expressar a concentração de glicose em mg por 100 ml de plasma. Tabela IV Tubo Glicerol (µl) H O (µl) Reagente (ml) DO 500 nm Padrões Amostras (Nota: O volume a colocar nos tubos 4 e 5 é de plasma e não do padrão) Triglicerídeos normais (humanos, em jejum): < 170 mg/ 100 ml 10

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