DEPARTAMENTO DE ZOOLOGIA FACULDADE DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA UNIVERSIDADE DE COIMBRA PERMEABILIDADE DAS MEMBRANAS CELULARES

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1 DEPARTAMENTO DE ZOOLOGIA FACULDADE DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA UNIVERSIDADE DE COIMBRA FISIOLOGIA ANIMAL II AULA 4 PERMEABILIDADE DAS MEMBRANAS CELULARES CAETANA CARVALHO, PAULO SANTOS

2 INTRODUÇÃO As membranas celulares que têm sido estudadas são invariavelmente permeáveis à água e mais ou menos permeáveis aos solutos que se encontram nos vários sistemas biológicos. Assim, conforme o tipo de moléculas (solutos), existem várias vias através das quais elas podem passar através das membranas celulares, como se esquematiza na Fig. 1. Póros Bicamada de lípidos Transportadores Moléculas polares e ionizadas atravessam por transporte mediado por transportadores Pequenas moléculas passam através dos póros Grandes e pequenas moléculas solúveis em lípido passam através dos lípidos da membrana Fig.1- Representação esquemática das várias vias através das quais diferentes tipos de moléculas podem atravessar as membranas celulares. Os factores principais que determinam a facilidade com que uma dada substância penetra a membrana são: 1) Dimensão da molécula da substância. 2) Carga eléctrica. 3) Solubilidade em lípidos. Nesta aula estudar-se-á a permeabilidade da membrana plasmática dos glóbulos vermelhos à água e a vários tipos de solutos. As membranas biológicas funcionam como membranas semi-permeáveis, que são livremente permeável à água, que passa de um compartimento para o outro de acordo com os gradientes de concentração dos solutos. Assim, suponhamos que temos duas soluções de sacarose de concentrações 1 M e 2 M, respectivamente, separadas por uma membrana semi-permeável (membrana que permite a passagem das moléculas de água, mas é completamente impermeável às moléculas de sacarose) (Fig. 2). 2

3 a A sacarose 2 M H 2 O H 2 O B sacarose 1 M Fig.2- A altura da coluna de solução reflecte a diferença de pressão osmótica entre as duas soluções (o volume da coluna deve ser insignificante em relação ao volume total da solução. Num sistema como este há, em média, mais moléculas de água que passam da solução 1 M para a solução 2 M, do que vice-versa. Em principio, passará de B para A a água necessária para que as duas soluções fiquem com igual concentração de soluto (mesmo número de partículas por unidade de volume). A pressão que seria necessário exercer para que não passasse água de B para A é igual à pressão osmótica (pressão causada pela diferença de concentrações dos solutos nas duas soluções). A pressão osmótica é função do número de partículas em solução por unidade de volume. Uma solução de NaCl 1 M manifesta uma pressão osmótica duas vezes maior que a duma solução de sacarose 1 M, uma vez que o NaCl se dissocia em solução e a sacarose não (Fig. 3). 1 M NaCl 1 M Na M Cl - 1 M sacarose 1 M sacarose sacarose 1 M sac + Na H 2 O H 2 O NaCl 1 M - Cl Fig. 3- A pressão osmótica desenvolvida por uma solução 1 M de NaCl é maior do que a pressão osmótica desenvolvida por uma solução 1 M de sacarose, uma vez que o NaCl se dissocia. Diz-se então que uma solução 1 M de NaCl é 2 osmolar, enquanto que uma solução 1 M sacarose é 1 osmolar. A pressão osmótica de um sistema pode calcular-se (com aproximação) pela expressão: P = nrt(c A -C B ) onde: P = pressão osmótica n = nº de iões que se forma quando a molécula se dissocia R = constante dos gases expressa em atmosfesras-litro por grau por mole (0,082) T = temperatura absoluta (0 ºC = 273 ºF) C A = concentração do soluto em A (moles / litro) C B = concentração do soluto em B (moles / litro) 3

4 PARTE PRÁTICA Nesta secção utilizam-se glóbulos vermelhos do sangue com a finalidade de estudar: A. A influência do gradiente de concentração de substância que penetra na velocidade de penetração. B. A relação entre o peso molecular da substância e a permeabilidade da membrana. 1 Preparação dos glóbulos vermelhos 1. Obter 20 ml de sangue heparinizado ou tratado com citrato. 2. Adicionar 30 ml de NaCl 0,15 M contendo 10 mm de tampão fosfato a ph 7,4. 3. Centrifugar a 2000 x g durante 4 min. 4. Deitar fora o sobrenadante e lavar de novo as células com NaCl 0,15 M tamponizado. 5. Ressuspender os glóbulos vermelhos em 30 ml de NaCl 0,15 M tamponizado. 2 Influência do gradiente de concentração da substância que penetra na velocidade de hemólise A velocidade de penetração da água nos glóbulos vermelhos será determinada indirectamente. À medida que a água entra, o glóbulo vermelho aumenta de volume até que rebenta (hemólise). Quanto mais rápida for a hemólise maior a velocidade de penetração da água. Procedimento: 1. preparar as seguintes soluções em tubos de ensaio: Tubo 0,15 M NaCl H 2 O (ml) (ml) Tabela I [NaCl] final (M) Osm. (mosm) Tempo de hemólise (s) 4

5 2. Adicionar ao 1º tubo 0,1 ml da suspensão de glóbulos vermelhos. Agitar o tubo imediatamente e accionar o cronómetro. 3. Colocar o tubo em frente do papel com letras. Anotar o tempo que foi necessário para voltar a ler as letras claramente. (Nesta altura ocorreu a hemólise de 75% das células). 4. Repetir os passos 2 e 3 para todos os outros tubos, anotando os tempos de hemólise na última coluna da Tabela I. Resultados: 1. Construir um gráfico em papel milimétrico que relacione o tempo de hemólise com a concentração de NaCl nos tubos 1 a Interpretar o gráfico obtido. 3 Relação entre as dimensões das moléculas e a permeabilidade Nesta experiência estuda-se a influência das dimensões moleculares na permeabilidade dos glóbulos vermelhos a várias moléculas. A hemólise reflecte a permeabilidade da membrana dos glóbulos vermelhos às várias substâncias. Uma vez que as moléculas utilizadas têm todas a mesma solubilidade em lípido e são electricamente neutras, os tempos de hemólise estão relacionados com as dimensões das moléculas. Procedimento: 1. Pipetar 10 ml de solução das substâncias indicadas na Tabela II para tubos de ensaio. 2. Pelo método descrito na experiência anterior determinar e registar os tempos de hemólise, após adicionar 0,1 ml de sangue a cada um dos tubos, individualmente. Tabela II Tubo Substância Peso molecular Tempo de hemólise (s) 1 Ureia 0,3 M 60 2 Glicerol 0,3 M 88 3 Glicose 0,3 M Sacarose 0,3 M 342 Conclusões: Qual a influência do tamanho na permeabilidade? 5

6 4 Determinação espectofotométrica da hemólise Nas experiências anteriores utilizou-se o método visual para determinar o tempo de hemólise dos glóbulos vermelhos. Contudo, um método mais rigoroso de seguir este processo é a determinação espectofotométrica da hemólise. Quando os glóbulos vermelhos do sangue são colocados numa solução hipotónica ocorre a entrada de água e as células aumentam de volume e, se a solução for suficientemente hipotónica, o aumento de volume leva à rotura da membrana celular que permite a perda do conteúdo intracelular que, no caso dos glóbulos vermelhos, é predominantemente hemoglobina. A quantidade de hemoglobina que passa para a solução reflecte o grau de hemólise. Assim, medindo a concentração de hemoglobina em solução pode determinar-se o grau de hemólise. Para determinar a concentração de hemoglobina utiliza-se um método espectofotométrico em que se mede a absorção da solução a um comprimento de onda característico da hemoglobina ( λ= 540 nm). Procedimento: 1. Preparar as soluções de NaCl (0 a 0,15 M), como se indica na Tabela III em tubos de centrifuga cónicos. Tubo 0,15 M NaCl H 2 O (ml) (ml) [NaCl] final (M) Tabela III Osm. (mosm) Absorvancia Hemólise (%) Adicionar a cada tubo 0,1 ml de suspensão de glóbulos vermelhos, misturar e deixar equilibrar 1 minuto. É necessário pipetar rigorosamente a suspensão de glóbulos vermelhos. 3. Centrifugar os tubos a 4000 rpm numa centrifuga de bancada durante 5 min, e decantar os sobrenadantes para tubos limpos. Ler a absorção da hemoglobina a 540 nm num espectofotómetro Spectronic 20. 6

7 4. Assumindo que no tubo 8 (água destilada) ocorreu hemólise máxima (100%), calcular a percentagem de hemólise nos outros tubos e fazer um gráfico relacionando a percentagem de hemólise com a concentração de NaCl. 5 Determinação automática da taxa de hemólise Nesta experiência obter-se-á o registo contínuo da taxa de hemólise utilizando um espectofotómetro Spectronic 20 ligado a um registador (Fig. 4). Determinar-se-á o efeito de substâncias de vários pesos moleculares na taxa de hemólise dos glóbulos vermelhos. Fig. 4- Representação esquemática da ligação do Spectronic 20 ao registador para registo contínuo da taxa de hemólise. 1-Interruptor; 2-Seleccionador de λ; 3- Porta-amostras; 4- Ajustar escala; 5-Escala de transmitância; 6-Escala de absorvência; 7- Registador. 7. Procedimento: 1. Ligar o registador ao espectofotómetro, utilizando um cabo apropriado, como se esquematiza na Fig. 4. Seleccionar um comprimento de onda onde se possa seguir a turbidez da suspensão de glóbulos vermelhos, por exemplo 610 nm. 2. Colocar um tubo no porta amostras do espectofotómetro contendo 3 ml de NaCl (0,15 M) e colocar dentro do tubo uma pequena barra magnética. Colocar um agitador magnético por baixo do espectofotómetro de modo a obter agitação contínua da solução dentro do tubo. 7

8 3. Calibrar o registador de modo a que o zero de absorvância coincida com o zero da escala de papel do registador, e que 0,2 de absorvância coincida com a posição 100 da escala. 4. Adicionar ao tubo um volume predeterminado de sangue (0,1 ml) e ajustar a agulha do registador para o centro da escala do papel com o zero do registador. Esta leitura representa a turbidez máxima da suspensão de glóbulos vermelhos numa solução isotónica de NaCl e é utilizada como ponto de referência para as experiências seguintes (Fig. 5). Portanto, não se deve alterar a posição zero do registador daqui em diante. 5. Repetir os passos 2 a 4 usando 3 ml de cada uma das soluções das substâncias indicadas na tabela seguinte: Tabela III Tubo Solução (0,3 M) 1 Ureia 2 Glicerol 3 Glicose 4 Sacarose 2 cm/min Glóbulos vermelhos Ureia 0,3 M NaCl 0,15 M Absorvência (610 nm) Fig. 5- Registo contínuo da alteração de volume de glóbulos vermelhos durante a hemólise numa solução de ureia (substancia permeante). A alteração de absorvância dá uma indicação da alteração de turbidez da suspensão. Resultados: Apresentar o registo contínuo da hemólise dos glóbulos vermelhos em ureia e em glicerol. Compara a velocidade de penetração das duas substâncias com o seu tamanho molecular. 8

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