Departamento de Zoologia da Universidade de Coimbra

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1 Departamento de Zoologia da Universidade de Coimbra Ana Luísa Carvalho Amplificação de um fragmento de DNA por PCR Numa reacção em cadeia catalizada pela DNA polimerase (Polymerase Chain Reaction - PCR), é possível amplificar especificamente um fragmento de DNA, tirando partido das características da DNA polimerase. Na reacção é necessário ter uma pequena quantidade do DNA que se pretende amplificar, e dois oligonucleótidos sintéticos de DNA, em cadeia simples, complementares às extremidades do fragmento de DNA a amplificar. Estes dois oligonucleótidos, os primers, devem ser adicionados à reacção em grande quantidade. São também necessários nucleótidos livres, para sintetizar novas cadeias de DNA. A reacção de PCR consiste numa sucessão de vários ciclos (normalmente entre 25 e 30 ciclos), em que cada ciclo consiste de três etapas, que correspondem a incubação da reacção a três temperaturas diferentes (Figura 1). Na primeira etapa, aquece-se a reacção a 95ºC, para provocar desnaturação das cadeias de DNA. Na segunda etapa, faz-se descer a temperatura até 50ºC-60ºC, para que os primers emparelhem com o DNA a que são complementares. Na terceira etapa, sobe-se a temperatura a 72ºC, temperatura óptima de funcionamento da DNA polimerase que se utiliza na reacção de PCR. Utiliza-se frequentemente a Taq polimerase, uma DNA polimerase extraída de Thermus aquaticus, um microorganismo termófilo, e que resiste sem desnaturar às altas temperaturas utilizadas durante a primeira etapa de cada ciclo da reacção de PCR (94ºC). A Taq polimerase polimeriza novas cadeias de DNA a partir dos primers de DNA, tendo como molde as cadeias de DNA previamente desnaturadas, às quais os primers se ligaram especificamente. Este ciclo de três etapas é repetido várias vezes. Em cada ciclo, o DNA sintetizado no ciclo anterior serve de molde à síntese de novas moléculas de DNA, de tal modo que a quantidade do fragmento de DNA pretendido aumenta exponencialmente. 1

2 A. Reacção de PCR (100 µl): Componentes Volume Concentração final DNA molde 1 µl ~10 ng/100 µl Tampão Taq polimerase (10 ) 10 µl 1 dntps 5 mm 4 µl 200 µm 20 _ M 2 µl 400 nm 20 _ M 2 µl 400 nm Taq polimerase (5U/_ l) 0.5 µl 2.5U/100 µl H 2 O até 100 µl Colocar reacções no aparelho de PCR (Termociclador) e programar o aparelho de modo a fazer os seguintes ciclos térmicos: 3 min 94ºC 30 ciclos: 30 seg 94ºC 30 seg 55ºC 1 min 72ºC 10 min 72ºC 4ºC NOTA: Usar material e soluções esterilizados e usar luvas para trabalhar com DNA. 2

3 Figura 1 Fragmento a amplificar DNA molde Adicionar excesso dos primers P1 e P2, dntps e Taq polimerase Aquecer a 95ºC para desnaturar DNA Arrefecer a 60ºC para que os primers emparelhem com o DNA molde 1º Ciclo Extensão dos primers pela Taq polimerase (72ºC) Aquecer a 95ºC para desnaturar DNA Arrefecer a 60ºC para que os primers emparelhem com o DNA mole Extensaão dos primers pela Taq polimerase (72ºC) 2º Ciclo Total de 30 ciclos 3

4 B. ELECTROFORESE EM GEL DE AGAROSE DO FRAGMENTO DE DNA AMPLIFICADO POR PCR 1. Preparação do gel de agarose 1% em TAE (50 ml): Pesar agarose Adicionar TAE (1 ) Aquecer no micro-ondas para derreter a agarose Deixar arrefecer Adicionar 2 _ l de brometo de etídeo 10 mg/ml Verter na tina de electroforese e deixar solidificar 2. Preparação das amostras: adicionar Loading Buffer, na diluição de 1:10, às amostras a correr no gel 3. Electroforese: Aplicar as amostras no gel, a par com um padrão contendo fragmentos de DNA de tamanhos conhecidos. Correr a electroforese a 100V. 4. Visualizar o DNA colocando o gel no transiluminador, e fazendo incidir radiação UV. O DNA adquire cor laranja. 50 TAE (500 ml) 121 g Tris 28.5 ml ácido acético glacial 50 ml 0.5 M EDTA, ph 8 H 2 O até 500 ml 4

5 10 Loading Buffer 10 g Ficoll ml 0.5 M EDTA 30 ml H 2 O 5 ml 10% SDS g Azul de Bromofenol g Xileno de Cianol Brometo de etídeo (10 mg/ml) 250 mg de brometo de etídeo em 25 ml ml de H 2 O; proteger da luz. 5