BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL

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1 Departamento de Bioquímica Instituto de Química USP Apostila de protocolos BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL QBQ 06N 0 Professores Carlos T. Hotta Ronaldo B. Quaggio Eduardo M. Reis Esta apostila foi desenvolvida originalmente por: Bayardo B. Torres Iolanda M, Cuccovia Maria Têresa Machini Miranda Pedro Soares de Araújo Remo Trigoni Jr. Sandro R. Marana

2 Prática Lise de células de levedura Objetivos romper células de Saccharomyces cerevisiae. Reagentes Materiais Aparelhos água destilada células de levedura (fase log tardia) etanol (EtOH) banho de gelo pérolas de vidro 0,5 mm ø pipetadores centrífuga estufa freezer 00 mm fluoreto de α-fenilmetilsulfonila pipetas vórtice (PMSF) em EtOH 0 g/l hipoclorito de sódio (água sanitária) tampão fosfato 00 mm ph 7,0 com 5 mm EDTA (tampão de lise) provetas suporte para tubos tubos de centrífuga tubos de ensaio tubos Falcon Procedimento A Fracionamento celular ATENÇÃO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO. Em um tubo de centrífuga com tampa colocar aproximadamente g (peso úmido) de células de leveduras crescidas até a fase logarítmica tardia. Adicionar ml de tampão de lise. Ressuspender as células usando um vórtice. Adicionar 0 µl de PMSF (00 mm) em etanol 5. Homogeneizar em vórtice 6. Adicionar à suspensão 8 ml de pérolas de vidro lavadas e secas 7. Agitar ininterruptamente em vórtice durante min (processo de lise) 8. Resfriar em banho de gelo por min 9. Repetir as operações 7 e 8 por mais vezes 0. Centrifugar a suspensão de células + pérolas de vidro a 850 g (g = aceleração da gravidade) por min. Remover cuidadosamente o sobrenadante passando-o para um tubo Falcon limpo e identificado como LISADO ( evitar coletar o material precipitado). Repetir as etapas a por mais vezes, reunindo os sobrenadantes no mesmo tubo LISADO. Usando uma proveta, determinar o volume do LISADO. Dividir o lisado em alíquotas de igual volume e transferí-las para tubos Falcon 5. Identificar os tubos com o número do grupo para armazenagem em freezer a 0 o C Procedimento B Lavagem das pérolas de vidro (executado pelas técnicas). Transferir as pérolas de vidro para um erlenmeyer. Adicionar hipoclorito de sódio no erlenmeyer. Agitar algumas vezes durante 5 min. Descartar cuidadosamente o hipoclorito de sódio (x) 5. Adicionar água no erlenmeyer 6. Lavar as pérolas 7. Descartar cuidadosamente a água 8. Repetir as etapas 6 a 8 por mais 5 vezes 9. Adicionar etanol no erlenmeyer 0. Colocar o erlenmeyer numa estufa e aguardar a secagem das pérolas

3 Prática Dosagem de açúcares redutores Objetivos dosar colorimetricamente açúcares solúveis no lisado de Saccharomyces cerevisiae. Reagentes Materiais Aparelhos água destilada lisado de leveduras (P) 0 g/l DNS 5 mm Glicose tubos de ensaio grandes cubetas para leitura pipetadores pipetas ponteiras espectrofotômetro vórtice ATENÇÃO! A PRÁTICA E A PRÁTICA PODEM SER FEITAS SIMULTANEAMENTE! Procedimento A Curva-padrão de proteína. Em cada tubo, adicionar as quantidades estipuladas de água e glicose, conforme a Tabela. Adicionar a quantidade necessária de reagente de DNS. Homogeneizar em vórtex. Colocar os tubos em banho-maria fervente por 0 min 5. Esfriá-los em água corrente 6. Adicionar 9 ml de água destilada, completando o volume para 0 ml totais 7. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços, não se esqueça de anotar a posição de cada tubo 8. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 50 nm no leitor de microplacas 9. Completar a Tabela tubos Soluçãopadrão glicose (µl) Tabela Água (µl) DNS Branco 0 00,0 0 90,0 0 80,0 0 70,0 0 60, , , , ,0 Solução padrão de glicose = 5 mm = 5 mmol/l = 5 µmol/ml Massa molar glicose = 80 g/mol

4 tubos Massa de glicose (mg) Tabela Réplica Réplica Réplica Procedimento B Dosagem de açúcares redutores no lisado obtido. Agitar o lisado suavemente por inversão. Diluí-lo como indicado abaixo OBSERVAÇÃO: para esse procedimento é necessário que o lisado seja diluído. Para isso segue o procedimento para diluição 00x:. Transferir 0, ml do lisado para um tubo de ensaio grande identificado como L0X. Adicionar 0,9 ml de água destilada. Homogeneizar em vórtice. Transferir 0, ml do tubo L0x para um tubo de ensaio grande identificado como L00X 5. Adicionar 0,9 ml de água destilada 6. Homogeneizar em vórtice ATENÇÃO! Este diluição deverá ser utilizada na Prática!. Preparar os tubos segundo a Tabela. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços, não se esqueça de anotar a posição de cada tubo 5. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 50 nm no leitor de microplacas 6. Completar a Tabela Tabela tubos Amostras Água DNS (µl) Branco 0,5 H O 0,75,0 Lisado 0,5 0,75,0 L0x 0,5 0,75,0 L00x 0,5 0,75,0 tubos Réplica Branco Lisado L0x L00x Tabela Réplica Réplica

5 Prática Dosagem de proteína Objetivos dosar colorimetricamente proteínas no lisado de Saccharomyces cerevisiae. Reagentes Materiais Aparelhos água destilada albumina 0, g/l lisado de leveduras (P) reagente de Bradford (ácido fosfórico 85%, Coomassie Blue G, metanol) papel de filtro cubetas para leitura pipetadores pipetas ponteiras suporte para tubos tubos de ensaio espectrofotômetro vórtice Procedimento A Curva-padrão de proteína. Adicionar em cada tubo os volumes de albumina e água estipulados na Tabela 5. Adicionar o reagente de Bradford (garanta que tenha se passado pelo menos 5 min a partir deste ponto antes de medir as amostras no espectrofotômetro). Homogeneizar em vórtice. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços, não se esqueça de anotar a posição de cada tubo 5. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 595 nm no leitor de microplacas 6. Completar a Tabela 6 tubos Albumina 0, g/l (µl) Tabela 5 Água (µl) Reagente de Bradford Branco 0 00,0 0 90,0 0 80,0 0 70,0 0 60, , , , , tubos Massa de proteína (mg) Tabela 6 Réplica (A 595 ) Réplica (A 595 ) Réplica (A 595 ) 5

6 Procedimento B Dosagem de proteínas no lisado de Saccharomyces cerevisiae. Adicionar em cada tubo os volumes de água e amostras do lisado diluído (L00x) estipulados na Tabela 7. Adicionar o reagente de Bradford (garanta que tenha se passado pelo menos 5 min a partir deste ponto antes de medir as amostras no espectrofotômetro). Homogeneizar em vórtice. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços, não se esqueça de anotar a posição de cada tubo 5. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 595 nm no leitor de microplacas 6. Completar a Tabela 8 OBSERVAÇÃO: Caso a absorbância das amostras experimentais esteja fora dos limites das absorbâncias obtidas na curva-padrão, discuta com o professor ou monitor um novo valor de diluição. Tabela 7 tubos L00x (µl) Água (µl) Reagente de Bradford Branco 0 00,0 A 00 0,0 A 50 50,0 A 0 70,0 A 0 80,0 tubos Réplica (A 595 ) Branco A A A A Tabela 8 Réplica (A 595 ) Réplica (A 595 ) 6

7 Prática Determinação da atividade enzimática Objetivos determinar a atividade da α-glicosidase no lisado de Saccharomyces cerevisiae. Reagentes Materiais Aparelhos água destilada lisado de leveduras (P) banho de gelo microplacas de 96 poços banho a 0 o C espectrofotômetro de 8 mm p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc) pipetadores microplacas em água tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) pipetas ponteiras vórtice tampão carbonato-bicarbonato 50 mm suportes para tubos de ensaio (ph,0) tubos de ensaio Procedimento A diluição do lisado de Saccharomyces cerevisiae ATENÇÃO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO Abaixo segue o procedimento sugerido para a diluição da preparação do lisado de Saccharomyces cerevisiae.. Transferir 0,7 ml do lisado de Saccharomyces cerevisiae para um tubo identificado como L0X. Adicionar 6, ml de água destilada gelada e homogeneizar suavemente. Transferir, ml de L0X para um novo tubo identificado como L50X. Adicionar 5,6 ml de água destilada gelada e homogeneizar suavemente 5. Transferir 0,7 ml de L50X para um novo tubo identificado como L500X 6. Adicionar 6. ml de água destilada gelada e homogeneizar suavemente 7. Manter todos os tubos no gelo Procedimento B determinação da atividade da α-glicosidase ATENÇÃO! Este procedimento deve ser feito para cada uma das diferentes diluições do lisado que foram preparadas. Todos estes ensaios podem ser montados simultaneamente, iniciando o procedimento sempre pela adição do substrato. Somente quando todos os tubos já tiverem recebido o substrato deverá ser iniciada a adição das diferentes diluições de lisado.. Preparar os tubos em de gelo. Adicionar em cada tubo os volumes de NPαGlc estipulados na Tabela 9. Adicionar em cada tubo o lisado devidamente diluído. Guarde o resto do lisado para a Prática 5. Transferir simultaneamente todos os tubos para o banho a 0 o C 5. Incubar os tubos pelos intervalos de tempos indicados na Tabela 9 6. Ao remover cada tubo, interromper a reação enzimática adicionando ml de tampão carbonatobicarbonato ph,0 7. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente 8. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços, não se esqueça de anotar a posição de cada tubo. Sugestão: use uma linha da placa por diluição 9. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 0 nm no leitor de microplacas 0. Completar as Tabelas 0 a 7

8 tubos 8 mm NPαGlc Tabela 9 tampão fosfato ph 7,0 lisado diluído (L0x, L50x ou L500x) tempo de incubação a 0 o C (min) 0, 0, 0, 5 0, 0, 0, 0 0, 0, 0, 5 0, 0, 0, 0 tubos réplica tubos réplica tubos réplica Tabela 0 L0x Tabela L50x Tabela L500x réplica réplica réplica réplica réplica réplica.. Curva padrão do p-nitrofenolato Abs 0 nm y = 0.009x R² = p-nitrofenolato (nmol) 8

9 Prática 5 Caracterização da enzima ph ótimo Objetivos Determinar o efeito do ph na atividade catalítica da α-glicosidase. Reagentes Materiais Aparelhos água destilada lisado de leveduras (P) banho de gelo microplacas de 96 poços banho a 0 o C espectrofotômetro de 8 mm p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc) pipetadores microplacas em água tampão borato 00 mm (ph 8,0) tampão borato 00 mm (ph 9,0) tampão citrato 00 mm (ph,0) tampão citrato 00 mm (ph 5,0) tampão citrato 00 mm (ph 6,0) tampão carbonato-bicarbonato 50 mm (ph,0) pipetas ponteiras suportes para tubos de ensaio tubos de ensaio vórtice Procedimento A Ensaio da atividade enzimática. Utilize a diluição do lisado que gerou o melhor resultado na Prática anterior, consulte o professor ou o monitor em caso de dúvida.. Realizar os ensaios de atividade enzimática sobre p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc) em 5diferentes valores de ph. As medições feitas na Prática serão consideradas como um sexto valor de ph. Preparar em banho de gelo, para todos os tampões diferentes, um conjunto de tubos para os ensaios de atividade de acordo com a Tabela. Misturar cuidadosamente 5. Adicionar o lisado (devidamente diluído) de Saccharomyces cerevisiae 6. Agitar manualmente com cuidado 7. Transferir todos os tubos do gelo ao mesmo tempo para um banho a 0 o C 8. Incubar os tubos pelos intervalos de tempos indicados na Tabela 9. Ao retirar cada tubo do banho, interromper a reação enzimática pela adição de ml de tampão carbonato-bicarbonato 0. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços, não se esqueça de anotar a posição de cada tubo. Sugestão: use uma linha da placa por ph. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 0 nm no leitor de microplacas. Completar as Tabelas a 8. Determinar graficamente o ph ótimo da α-glicosidase 9

10 Tabela tubos 8 mm NPαGlc Tampão lisado diluído tempo (min) 0, 0, 0, 5 0, 0, 0, 0 0, 0, 0, 5 0, 0, 0, 0 Tabela Tabela 5 ph =,0 ph = 5,0 Tubos réplica réplica réplica Tubos réplica réplica réplica Tabela 6 Tabela 7 ph = 6,0 ph = 8,0 Tubos réplica réplica réplica Tubos réplica réplica réplica Tabela 8 ph = 9,0 Tubos réplica réplica réplica 0

11 Prática 6 Purificação de proteínas SDS-PAGE Objetivos Analisar a composição de proteínas do lisado Reagentes tampão de amostra água solução C glicerol 00 g/l SDS 5 g/l azul de bromofenol β-mercaptoetanol,55 ml,5 ml,50 ml,00 ml 0,0 ml 0,05 ml solução A acrilamida N N bis metilenoacrilamida água 9, g 0,80 g 00 ml solução de coloração Coomassie blue R metanol ácido acético água 0, g 0 ml 0 ml 50 ml solução B,5 M Tris (acertar valor de ph com HCl) ph 8,8 solução de descoloração metanol ácido acético água 0 ml 0 ml 50 ml solução C 0,5 M Tris (acertar valor de ph com HCl) ph 6,8 tampão de corrida tris,0 g glicina, g 00 g/l SDS,0 g água L Obs.: Não acertar o ph desta solução tampão Procedimento A diálise e secagem das amostras Diálise das amostras. Transferir para um microtubo 0 µl do lisado de Saccharomyces cerevisiae. Identificar o microtubo com o número do grupo.. Adicionar água até completar 600 µl. Cobrir o microtubo com um pedaço de membrana de diálise 5. Prender a membrana de diálise com um anel de borracha 6. Transferir o microtubo para um suporte de isopor 7. Colocar o suporte dentro de um béquer contendo água 8. Manter em agitação por pelo menos 6 h Secagem a vácuo (executado pelas técnicas) 9. Após a diálise, transferir as amostras para um concentrador a vácuo 0. Secar as amostras

12 Procedimento B preparação do gel de SDS-PAGE (feito pelas técnicas) Preparação do gel de separação. Adicionar em um tubo os volumes estipulados na Tabela 9. Homogeneizar rapidamente. Transferir a mistura, utilizando uma pipeta Pasteur, para as placas de vidro previamente montadas. Aguardar a polimerização cerca de 60 min 5. Colocar o pente entre as placas de vidro Preparação do gel de empilhamento 6. Após a polimerização do gel de separação, adicionar em outro tubo os volumes estipulados na Tabela 0 7. Homogeneizar rapidamente 8. Transferir a mistura, utilizando uma pipeta Pasteur, para as placas de vidro (com o pente) contendo o gel de separação polimerizado 9. Aguardar a polimerização cerca de 0 min 0. Após a polimerização do gel de empilhamento, retirar cuidadosamente o pente. Adicionar o tampão de corrida Tabela 9 soluções volume água,0 ml 00 g/l SDS 00 µl solução A, ml solução B,5 ml TEMED 5 µl persulfato de amônio 50 µl Tabela 0 soluções volume água,05 ml 00 g/l SDS 50 µl solução A 0,65 ml solução C,5 ml TEMED 5 µl persulfato de amônio 5 µl Procedimento C desnaturação das amostras, eletroforese e coloração do gel. Transferir para cada microtubo 0 µl de tampão de amostra. Transferir os microtubos para um banho fervente. Incubar os microtubos por 5 min. Aplicar as amostras no gel de eletroforese com o auxílio de micropipetadores 5. Correr a eletroforese com 00 V, durante aproximadamente 90 min 6. Desligar a fonte quando o corante marcador de frente atingir a base do gel 7. Desconectar os cabos 8. Retirar o gel 9. Colocar o gel no frasco contendo a solução de coloração 0. Corar o gel por 0 min. Retirar o gel do frasco de coloração. Colocar o gel no frasco contendo a solução de descoloração. Descorar o gel. Visualizar as bandas de proteínas

13 Prática 7 Purificação de proteínas cromatografia de troca iônica Objetivos Isolar a α-glicosidase utilizando resina de troca iônica. Procedimento A Montagem da coluna de troca iônica (executado pelas técnicas) Hidratação da DEAE-Sephadex (executado pelas técnicas). Pesar 0,5 g de DEAE-Sephadex em um béquer. Adicionar 00 ml de tampão fosfato 0 mm ph 6,8. Misturar bem utilizando um bastão de vidro. Decantar de um dia para o outro Montagem da coluna 5. Utilizar o barril de uma seringa (0 ml) como suporte da resina 6. Prender a seringa em um suporte 7. Colocar um pouco de lã de vidro no seu interior 8. Compactar a lã de vidro na base utilizando um bastão de vidro 9. Lavar a coluna com água destilada para retirar fragmentos de lã de vidro 0. Adaptar uma mangueira de aproximadamente 6 cm na saída da pipeta. Fechar a mangueira com uma presilha Processo de empacotamento. Fechar a presilha. Homogeneizar com um bastão de vidro a suspensão contendo a resina (Procedimento A). Adicionar a suspensão até a marca de,0 ml 5. Deixar decantar 6. Repetir essa operação até a resina sedimentada ocupar o interior da seringa até,0 ml 7. Com a resina empacotada, lavá-la com 0 ml de tampão fosfato 0 mm sem NaCl 8. Após a lavagem, fechar a presilha 9. Deixar mm de tampão acima do topo da resina 0. NUNCA DEIXAR A RESINA SECAR

14 Procedimento B Cromatografia de troca iônica Preparação da amostra. Descongelar o lisado, transferir uma alíquota de,0 ml para um tubo tipo eppendorf e centrifugar a g por s. Coletar o sobrenadante para usar nas etapas abaixo.. Parte de material (0, ml) será usada na cromatografia abaixo, enquanto que o restante (0,6 ml) deverá ser guardado congelado para os próximos passos. Preparação da coluna. Diluir 0, ml do sobrenadante do lisado (ver etapa anterior) adicionando 0,6 ml de tampão fosfato 0 mm sem NaCl. É muito importante que apenas o sobrenadante do lisado seja usado para evitar entupimento da coluna.. Verificar se a presilha está fechada. 5. Utilizar uma pipeta para transferir toda a amostra (devidamente diluída) homogeneamente para a coluna. 6. Colocar o tubo na saída da coluna e abrir a presilha. 7. Deixar a amostra escoar pela coluna até cerca de mm acima do topo da resina. 8. Fechar a presilha e transferir o tubo para o gelo. Eluição das proteínas não retidas pela coluna 9. Adicionar cuidadosamente ml de tampão fosfato sem NaCl 0. Colocar o tubo na saída da coluna e abrir a presilha permitindo que o tampão flua pela resina. Coletar ml em cada tubo de ensaio. Trocar o tubo de ensaio e sempre adicionar mais ml de tampão. Fechar a presilha ao final da coleta do tubo 8. Adicionar cuidadosamente mais,0 ml de tampão. Assim, acima da resina deverá haver,0 ml de tampão 5. Coletar mais dois tubos, sem adicionar tampão 6. Ao final da coleta do tubo 0, o tampão deverá estar cerca de mm acima do topo da resina Eluição das proteínas retidas pela coluna 7. Adicionar cuidadosamente,0 ml de tampão fosfato com NaCl 8. Abrir a presilha e permitir que o tampão flua pela resina 9. Coletar,0 ml em cada tubo de ensaio 0. Trocar o tubo de ensaio e sempre adicionar mais ml de tampão. Fechar a presilha ao final da coleta do tubo 8. Adicionar,0 ml de tampão. Assim, acima da resina deverá haver,0 ml de tampão. Coletar mais dois tubos, sem adicionar tampão. Fechar a presilha ao final da coleta do tubo 0. Não deixar a coluna secar

15 Procedimento C Identificação das frações que contêm a α-glicosidase ATENÇÃO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO. Preparar um conjunto de tubos numerados de a 0. Adicionar em cada tubo 0, ml de mm NPαGlc. Transferir os tubos em banho de gelo. Adicionar em cada um destes tubos 0, ml das frações coletadas durante a cromatografia. Transferir todos os tubos ao mesmo tempo para um banho de 0 o C 5. Incubar os tubos por 0 min 6. Ao remover os tubos, adicionar em cada um ml de tampão carbonato-bicarbonato ph,0 8. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente 9. Colocar 00 µl de cada tubo em um pocinho da sua microplaca de 96 poços 0. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 0 nm no leitor de microplacas 7. Completar a Tabela 8. Construir um gráfico Absorbância versus números dos tubos 9. Uma vez identificados os tubos que contém atividade enzimática após a eluição com NaCl, reunir as frações correspondentes em um tubo Falcon identificado como MATERIAL DEAE número do grupo Tabela tubos A 0 tubos A Procedimento D Determinação da atividade enzimática do lisado de S. cerevisiae ATENÇÃO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO Todos os tubos deste ensaio podem ser montados simultaneamente. Diluir o 00 µl ou menos de sobrenadante do lisado guardado no Procedimento B para gerar ml de lisado diluído (utilizar a diluição escolhida na Prática ). Adicionar em cada tubo os volumes de NPαGlc estipulados na Tabela. Adicionar em cada tubo o sobrenadante do lisado devidamente diluído. Transferir todos os tubos ao mesmo tempo para o banho a 0 o C 5. Incubar os tubos pelos intervalos de tempos indicados na Tabela 6. Ao remover cada tubo, interromper a reação enzimática adicionando ml de tampão carbonatobicarbonato ph,0 7. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente 8. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços 9. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 0 nm no leitor de microplacas 0. Completar a Tabela. Com os dados obtidos determinar a concentração de atividade enzimática de α-glicosidase (mu/ml) presente no sobrenadante do lisado 5

16 tubos mm NPαGlc Tabela água destilada lisado diluído tempo de incubação a 0 o C (min) 0, - 0, 5 0, - 0, 0 0, - 0, 5 0, - 0, 0 tubos réplica Tabela réplica réplica Procedimento E Determinação da atividade enzimática no material DEAE Este procedimento pode ser feito junto com o procedimento E. Dilua o material DEAE, transferindo 0, ml do material DEAE e,8 ml de água destilada para um tubo identificado como DEAE-0X. Homogeneizar suavemente e manter no gelo. Adicionar em cada tubo de ensaio os volumes de NPαGlc e material DEAE (diluído 0x) estipulados na Tabela. Transferir todos os tubos ao mesmo tempo para um banho a 0 o C e incubar os tubos pelos intervalos de tempos indicados na Tabela. Ao remover cada tubo, interromper a reação enzimática adicionando ml de tampão carbonatobicarbonato ph,0 5. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente 6. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços 7. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 0 nm no leitor de microplacas e completar a Tabela 5 8. Calcular a atividade da α-glicosidade no Material DEAE. tubos mm NPαGlc Tabela Material DEAE (diluído 0x) tempo de incubação a 0 o C (min) 0, 0, 5 0, 0, 0 0, 0, 5 0, 0, 0 tubos réplica Tabela 5 réplica réplica 6

17 Procedimento F Dosagem de proteínas do material DEAE ATENÇÃO! O material DEAE usado neste procedimento não deve ser diluído Este procedimento pode ser feito junto com o procedimento G. Adicionar em cada tubo os volumes de água e material DEAE estipulados na Tabela 6. Adicionar o reagente de Bradford. Homogeneizar em vórtice e aguardar 5 minutos. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços, não se esqueça de anotar a posição de cada tubo 5. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 595 nm no leitor de microplacas 6. Completar a Tabela 7 Tabela 6 Tubos Material DEAE Água Reagente de Bradford Branco - 0,,0 0, -,0 0, -,0 0, -,0 tubos Réplica Branco Tabela 7 Réplica Réplica Procedimento G Dosagem de proteínas do lisado. Diluir 0x o lisado obtido após centrifugação. Transferir 0, ml do lisado para um tubo e adicionar,9 ml de água destilada. Adicionar em cada tubo os volumes de lisado diluído estipulados na Tabela 8. Homogeneizar em vórtice e aguardar 5 minutos. Usar o branco para calibrar (zerar) o espectrofotômetro 5. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços, não se esqueça de anotar a posição de cada tubo 6. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 595 nm no leitor de microplacas 7. Completar a Tabela 9 Tabela 8 Tubos Lisado diluído Água Reagente de Bradford 0, -,0 0, -,0 0, -,0 tubos Réplica Tabela 9 Réplica Réplica 7

18 Prática 8 Caracterização da α glicosidase: Km e Vmax Objetivos Caracterizar a α-glicosidase de Saccharomyces cerevisiae através das determinações da afinidade (K m ) da enzima pelo substrato (p-nitrofenol-α-glicosídeo) e da velocidade máxima (V max ) de hidrólise do substrato. Reagentes Materiais Aparelhos água destilada lisado de levedura,0 mm p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc) em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0),0 mm NPαGlc em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) 8,0 mm NPαGlc em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) tampão carbonato-bicarbonato 50 mm (ph,0) tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) banho de gelo microplacas de 96 poços pipetadores pipetas ponteiras suportes para tubos de ensaio tubos de ensaio banho a 0 o C espectrofotômetro de microplacas vórtice Procedimento A Medidas de velocidade da reação de hidrólise do substrato ATENÇÃO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO. Utilize a diluição usada na Prática. O volume total necessário será de 5,0 ml. Adicionar em cada tubo os volumes de NPαGlc estipulados na Tabela 0. ATENÇÃO: prestar atenção nas diferentes concentrações de substrato. Preparar os tubos em banho de gelo. Adicionar em cada tubo os volume de tampão e lisado (devidamente diluído) estipulados na Tabela. Agitar manualmente com cuidado 5. Transferir todos os tubos do gelo para o banho a 0 o C 6. Incubar todos os tubos por 0 min, se a quantidade de produto da reação começar a saturar, interrompa a reação. Peça ajuda para o professor ou do monitor para tomar esta decisão. Também consulte o professor ou o monitor, se não houver a formação de produto visível após 0 min. 7. Remover todos os tubos do banho 8. Adicionar ml de tampão carbonato-bicarbonato 9. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente 0. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 0 nm no leitor de microplacas e completar a Tabela. Construir os gráficos necessários para a determinação do K m e V max da α-glicosidase para o substrato utilizado 8

19 tubos mm NPαGlc mm NPαGlc Tabela 0 8 mm NPαGlc Tampão fosfato 00 mm ph 7 Lisado diluído 0, ,8 0,0 0, ,6 0,0 6 0, , 0,0 0, - - 0,8 0,0 5 0, , 0,0 6 0, ,0 0,0 7-0,6-0, 0,0 8-0,0-0,0 0, ,0 0,0 0, , 0,7 0, ,5 0,5 0,0 Tabela tubos réplica réplica réplica 9

20 Prática 9 Caracterização da α glicosidase: determinação de padrão de inibição por maltose Objetivos Determinar o padrão de inibição de maltose sobre a hidrólise de p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc) efetuada pela -glicosidase de Saccharomyces cerevisiae Reagentes Materiais Aparelhos água destilada lisado de levedura,0 mm p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc) em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0),0 mm NPαGlc em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) 8,0 mm NPαGlc em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) 0, M maltose em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0), M maltose em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0),6 M maltose em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) tampão carbonato-bicarbonato 50 mm (ph,0) em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) banho de gelo microplacas de 96 poços pipetadores pipetas ponteiras suportes para tubos de ensaio tubos de ensaio banho a 0 o C espectrofotômetro de microplacas vórtice Procedimento A Medidas da velocidade de reação de hidrólise do substrato na presença de inibidor ATENÇÃO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO. Adicionar em cada tubo os volumes de NPαGlc e maltose estipulados na Tabela ATENÇÃO: prestar atenção nas diferentes concentrações de substrato e inibidor. Agitar manualmente com cuidado.. Transferir todos os tubos do gelo para o banho a 0 o C. Incubar todos os tubos pelo dobro do tempo usado na prática 8 5. Remover todos os tubos do banho. 6. Adicionar ml de tampão carbonato-bicarbonato. 7. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente 8. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços 9. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 0 nm no leitor de microplacas e completar a Tabela 0. Construir os gráficos necessários para a determinação do padrão de inibição da α-glicosidase por maltose. 0

21 tubos mm NPαGlc mm NPαGlc 8 mm NPαGlc Tabela 0, M maltose, M maltose Tampão fosfato 00 mm ph 7 Lisado diluído 0, ,0-0, 0,0 0, , ,0-0,6-0,0-0,0 0,0-0,0-0, , ,0 0,0-0,0 0, ,5 0,0-0,05 0,0 7 0, ,0 0, 0,0 8 0, ,0-0,0 9-0, ,0 0,0 0,0 0-0, ,0-0, ,0-0,0 0,0 0, ,5-0,0 0,05 0,0 Tabela tubos [S] final (mm) [I] final (mm) réplica réplica réplica