Em nossos experimento serão utilizadas células SH SY5Y, uma sublinhagem de células de neuroblastoma SK-N-SH, figura 1.

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1 Procedimentos Em nossos experimento serão utilizadas células SH SY5Y, uma sublinhagem de células de neuroblastoma SK-N-SH, figura 1. As células serão submetidas a estresse oxidativo por meio do tratamento com H 2 O 2. O efeito protetor, antioxidante de uma droga será avaliado. Tratamento das culturas celulares 1 Prepare uma placa de 10 cm semi-confluente (cerca de 80% de confluência) para cada ponto experimental. Para isso as células devem ser contadas e plaqueadas no dia anterior, na densidade adequada, neste caso 1 x 10 6 células/ml. 2 No fluxo laminar, remover o meio de cultura das placas e lavar 1x com 5 ml de PBS. 3 Neste experimento faremos dois tratamentos, A) Células tratadas com H 2 O 2 (250μM); B) Células tratadas com H 2 O 2 (250μM) + Droga X (100μM)

2 Utilizaremos como controle negativo células não tradas com H 2 O 2, e como controle positivo para morte por apoptose, células tratadas com etoposídeo. Tratamento A e tratamento B Tempo de exposição (minutos) Recuperação das células (horas) Adicionar H 2 O 2 diluído em PBS, o volume necessário para a concentração final de 250 μm (Tratamento A) e de H 2 O μm + Droga X 100 μm. Retornar com as placas para a estufa (37 C/5%CO 2 ) e incubar por 30 minutos. 6 Remover o meio de tratamento e lavar as culturas 2 vezes com 5 ml de PBS. Adicionar 10 ml de meio de cultura, DMEM + 15% SFB e incubar as placas na estufa por 0, 6, 12 e 24 horas. Ao final, remover o meio de cultura e lavar 1x com 5 ml de PBS, proceder ao isolamento de DNA e extração de proteínas totais.

3 Isolamento de DNA 1 Remova o PBS das placas e adicione 10 ml de tampão de lise (10 mm Tris HCl ph 8,2; 0,4M NaCl; 2 mm EDTA; 1% SDS); com a ajuda de rastelinho transfira as soluções para um tubo cônico de 15 ml e adicione 100 μl de proteinase K (5 mg/ml). Incube as amostras 1hora a 55ºC. 2 Adicione 2,5 ml de solução saturada de NaCl a cada tubo e agite (levemente) os tubos no banho a 55 C até que a solução esteja transparente. 3 Transfira os tubos para um banho de gelo e agite levemente até que se forme um precipitado branco. 4 Centrifugue os tubos a 1000xg por 10 min. Se ao final da centrifugação ainda forem observados flocos brancos na solução, centrifugue por mais 10 min. 5 Transfira os sobrenadantes para um novo tubo cônico de 50 ml, tomando muito cuidado para não transferir o precipitado. 6 Adicione 2,5 vol. (cerca de 25 ml) de etanol gelado a cada tubo e leve ao freezer por 1 hora. 7 Centrifugue as amostras a 1000xg por 10 min., descarte o sobrenadante. 8 Ressuspenda o precipitado em 10 ml de 70% etanol gelado e repita a centrifugação anterior. Descarte o sobrenadante e seque o precipitado em jato de N 2. 9 Adicione 500 μl de TE (Tris-HCl 10 mm, ph 8,2; EDTA 1 mm) a cada tubo e ressuspenda o precipitado (se necessário incube por 5 min. a 55 C para garantir a completa dissolução do precipitado). Adicione 50 μl de RNAse A (10 mg/ml) a cada tubo e incube por 1 hora a 55 ºC. 10 Adicione 9,5 ml de tampão de lise a 2,5 ml de solução saturada de NaCl. Repita os procedimentos como descrito do item 2 ao Ressuspenda o precipitado final em H 2 O deionizada. Quantificação e diluição do DNA 1 Usando o NanoDrop (microespectrofotômetro), meça a concentração da solução de DNA através da A 260nm. Avalie também a qualidade do DNA observando o espectro de absorção no UV ( nm). As razões A 260nm /A 280nm e A 260nm /A 230nm devem ser 1,8 para garantir que o DNA esteja livre de proteinas.

4 2 Dilua uma alíquota da sua amostra para 500 ng/μl em água deionizada autoclavada. Essa amostra será utilizada no ensaio de fragmentação. Resolução do DNA genônico em gel de agarose 1 Prepare um gel de agarose (molecular biology grade) a 1,0% em tampão TAE (Tris/Acetato/EDTA), dissolvendo 1,0 g de agarose em 100 ml de tampão, no microondas. Espere a solução gelificar no recipiente e dissolva novamente no micro-ondas (esse método garante uma completa dissolução dos grânulos de agarose). 2 Despeje a solução de agarose no suporte de gel, devidamente selado; espere até a completa gelificação. 3 Transfira o gel para a cuba de eletroforese e acrescente o volume necesário de tampão TAE para que o gel fique completamente submerso. 4 Prepare as amostras adicionando em cada tubo 10 μl de DNA isolado (5μg de DNA), 4 μl de tampão de amostra e 6 μl de dh 2 O. 5 Carregue as amostras no gel, tomando cuidado para colocar todo o conteúdo preparado. 6 Proceda a eletroforese a 100 V, por cerca de 2 horas, até que a frente de migração esteja bem próxima ao final do gel. 7 Remova o gel da cuba de eletroforese e trate com uma solução de brometo de etídeo (2mg/mL) por 10 min. Após essa etapa lave 1x com dh 2 O por 10 min. 8 Verifique em um transiluminador (UV) 9 Visualize os produtos no Typhoon PhosphorImager.

5 Extração de proteínas totais 1 Centrifugar o meio de cultura com as células em ambiente refrigerado 1000xg 2 Lavar com PBS gelado e centrifugar mais duas vezes a 1000xg 3 Descartar o sobrenadante, acrescentar o tampão de lise RIPA (40-50 μl) mais coquetel de inibidor de proteases. 4 Deixar no gelo por 20 minutos. 5 Sonicar as amostras. 6 Centrifugar a 4ºC/10min./1600xg. 7 Remover o sobrenadante e descartar o pellet. 8 Guardar o extrato total a -20 ºC. Quantificação de proteínas solúveis método de Bradford 1 Em uma micoplaca de 96 poços adicionar 190 μl do reagente de Bradford (1x). 2 Adicionar 10 μl de amostra aos poços com reagente de Bradford. 3 Proteger a placa da luz e esperar 10 minutos para ler a absorbância a 595 nm. 4 Calcular a quantidade de proteínas em cada amostra por meio da curva padrão preparada para o reagente de Bradford.

6 Western Blotting - Gel de poliacrilamida 12% - Gel de separação 12% 40% Bis- acrilamida 37:1 4,5 ml dh 2 O Tris-HCl 1,5 M ph 8,81 SDS 10% (m/m) TEMED Persulfato de amônio (PA) 6,5 ml 3,75 ml 150 μl 8 μl 80 μl - Adicionar o TEMED e PA por últimos nesta ordem. Esperar polimerizar o gel de separação e adicionar o gel de empilhamento. - Gel de empilhamento 5% 40% Bis- acrilamida 37:1 1,875 ml dh 2 O Tris-HCl 1,5 M ph 8,81 SDS 10% (m/m) TEMED Persulfato de amônio (PA) 10,980 ml 1,875 ml 150 μl 12 μl 120 μl

7 Eletroforese 1 Adicionar o volume correspondente a 15 μg de proteína em microtubos de centrifuga de 1,5 ml e tampão de amostra para a concentração final de 1X. 2 Aquecer as amostras por 5 min. a 95 C. 3 Aplicar as amostras no gel de poliacrilamida. 4 Proceder a eletroforese a uma diferença de potencial de 100 V por 5 minutos e o restante a 80 V até que o marcador azul de bromofenol alcance o final do gel. Transferência 1 - Ativar a membrana em metanol por pelo menos 1 min. 2 Transfira a membrana para a solução de transferência. 3 Monte o sistema de transferência na ordem: Parte negra espuma papel filtro gel membrana papel filtro espuma parte transparente. 4 Feche o aparato e coloque na cuba eletroforética com tampão de transferência gelado. Transfira a 125 V por 3 horas. Tratamento com os anticorpos 1 Bloquear a membrana com solução TBST (1x), 5% caseína (m/v) 5 ml, por uma hora a temperatura ambiente. 2 Incubar overnight com anticorpo primário para proteína de interesse, a 4 C. 3 Lavar a membrana 3 vezes por 5 min. com TBST (1x). 4 Incubar com o anticorpo secundário por 1 hora a temperatura ambiente. 5 Lavar a membrana 3 vezes por 5 min. com TBST.

8 Revelação 1 - Na câmara escura, preparar o filme fotográfico e a solução reveladora na proporção 1:1 (solução A: solução B), e aplicar o suficiente para cobrir a membrana. 2 Colocar o filme fotográfico no cassete. Deixar aproximadamente 5 min. Revelar.