Detecção feno+pica de ERCs em laboratórios de microbiologia clínica e importância médica

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1 Detecção feno+pica de ERCs em laboratórios de microbiologia clínica e importância médica Jorge Luiz Mello Sampaio Professor de Microbiologia Clínica Faculdade de Ciências FarmacêuFcas - USP Médico Responsável Microbiologia Fleury Medicina e Saúde

2 Roteiro Que critérios uflizar Por que não deve ser uflizado o teste de Hodge modificado Racional para triagem feno+pica de mecanismos de resistência O que testar adicionalmente, como testar e interpretar Cuidados no uso da automação Culturas de vigilância O que deve ser enviado aos LACENs

3 Que critério uflizar? Nota técnica 01/2013 ANVISA Antimicrobia no Concentração Inibitória Mínima Sensível (µg/ml) I (µg/ml) Resistente (µg/ml) Potência do Disco (µg) Disco-Difusão Sensível (mm) I (mm) Resistente (mm) Aztreonam Cefepima Ceftazidima A A 22 A A 18 A Ertapenem 0, Colistina ou B Polimixina B Tigeciclina C C 14 C

4 CLSI Faz senfdo? EUCAST

5 Por que não deve ser uflizado o teste de Hodge modificado?

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7 Solução de ácido fenilborônico Solução de ácido fenilborônico 40 mg/ml Ácido fenilborônico (Fluka ou Aldrich P20009) mg DMSO ml Água grau reagente ml Esterilizar por filtração 0,22 µm (opcional) A solução pode ser estocada por um mínimo de 3 meses a - 20 C; Aplicar 10 µl/ disco de imipenem e meropenem Deixar evaporar o excesso de umidade

8 Solução de cloxacilina Solução de cloxacilina 75 mg/ml Cloxacilina sal sódico monohidratado (Sigma C9333) mg Água grau reagente ml Esterilizar por filtração 0,22 µm A solução pode ser estocada por um mínimo de 3 meses a - 20 C; Aplicar 10 µl/ disco de imipenem e meropenem Deixar evaporar o excesso de umidade

9 Solução de EDTA 0,1M EDTA sal dissódico dihidratado (Merck ou Sigma E6635) - Mol = 372,24 g Preparo da solução EDTA ,86 g Água grau reagente ml Ajustar o ph para 7,5 com NaOH 5M Agitar até completa dissolução do EDTA Ajustar o volume para 50 ml em temperatura ambiente Distribuir em frascos com 1 ml cada Esterilizar em autoclave por 10 min a 121 C Estocar em temperatura ambiente por até 1 ano.

10 Cloxacilina 10 µl de solução 75 mg/ml IMI Sem adifvo MEM ERT MEM IMI IMI MEM MEM IMI Ácido fenilborônico 10 µl de solução 40 mg/ml EDTA 10 µl de solução 0,1M

11 KPC Carbapenemase de Klebsiella pneumoniae 2f A Hidrólise de carbapenêmicos, Bush Ambler cefalosporinas, penicilinas e cefamicinas. Pobremente inibidas por ácido clavulânico ou tazobactam.

12 KPCs 14 descritas até o momento (KPC- 1 = KPC- 2) Fonte: hqp:// São inibidas pelo ácido fenilborônico Não são inibidas pelo EDTA Não há potenciação com cloxacilina Não degradam eficientemente cefoxifna

13 Detecção de KPC com ácido fenilborônico Pode haver falso posifvo com AmpC plasmidial + perda de porina DiagnósFco diferencial: potenciação com cloxacilina Pos AmpC plasmidial + perda de porina Neg - KPC

14 Detecção com AFB Por enquanto aplicável apenas a enterobactérias NÃO pertencentes ao grupo CESP > 99% de correlação com detecção por PCR. Falsos posifvos com Grupo CESP

15 NDM New Delhi Metalobetalactamase 3a Bush B Ambler Hidrólise de todos os β- lactâmicos, exceto monobactâmicos. Inibidos por EDTA e quelantes de íons metálicos. Não inibidos por ácido clavulânico ou tazobactam. Outras: IMP e VIM

16 NDM Nove variantes descritas até o momento hqp:// América LaFna (Publicações) Guatemala Colombia

17 NDM Possuem duas moléculas de zinco no sífo afvo InaFvadas pelo EDTA e outros quelantes de cáfons divalentes (ácido dipicolínico)

18 Importante Outras metalo- betalactamases, como IMP, VIM e SPM apresentam posifvidade para esse teste (EDTA+).

19 Puro Cloxacilina EDTA Ácido Fenilborônico

20 Novo Desafio Microbiológico Metalo- β- lactamase Testar meropenem e imipenem com e sem EDTA; 10 μl de solução de EDTA 0,1M Deixar evaporar o excesso de umidade Nordmann et al., J Clin Microbiol. 2011;49(2): Aumento 5 mm com qualquer um dos substratos = provável MBL Confirmar por PCR e sequenciamento de DNA Pode haver falsos posifvos Ideal ácido dipicolínico (Sigma P63808) 1000 µg/disco NDM

21 Detecção de Resistência a carbapenêmicos E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis e outros não produtores de AmpC cromossômica Triagem com ertapenem (I ou R) EUCAST Determinar CIMs para Meropenem e Imipenem Discos de IMP e MEM com: Ácido fenilborônico 10 µl de solução 40 mg/ml EDTA 10 μl de solução de EDTA 0,1M Cloxacilina 10 µl de solução 75 mg/ml Tsakris A et al J Clin Microbiol Aug;49(8): Giske Jorge et al. Sampaio Clin Microbiol Infect 2011 Apr;17(4): Nordmann et al., J Clin Microbiol. 2011;49(2):

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23 Reforçando conceitos Grupo CESP Triagem com meropenem e imipenem Interpretar apenas o teste com EDTA Não CESP Triagem com ertapenem, imipenem e meropenem Interpretar AFB, cloxa e EDTA

24 Grupo CESP Citrobacter freundii Enterobacter spp. Serra9a spp. Providencia spp. Morganella morganii Hafnia alvei

25 Interpretando (não CESP) β-lactamase AFB EDTA CLOXA KPC + N N NDM/IMP/VIM N + N AmpC + perda porina + N + OXA-48 e outras N N N + = aumento 5 mm com um ou mais dos substratos

26 Importante Em casos de infecção a determinação das CIMs para imipenem e meropenem deve ser realizada por método não automafzado; A triagem de produção de carbapenemases em não CESP deve incluir o ertapenem.

27 Polimixinas Não uflizar disco- difusão; Paineis de microdiluição congelados a - 80 C; UFlizar Etest de colisfna e não polimixina B 48,7% de erros menores van der Heijden et al. Ann Clin Microbiol AnFmicrob. 2007;6:8.

28 Fosfomicina No CLSI só há critérios interpretafvos para E. coli em infecções urinárias Conduta pessoal: E. coli em ITU disco- difusão CLSI Todas as outras espécies de enterobactérias e sífos anatômicos determinação da CIM com Etest Critérios interpretafvos do EUCAST Sensível 32 mg/l Resistente 64 mg/l

29 Tigeciclina Não há critérios no CLSI M100- S23 Nota Técnica ANVISA 01/2013 EUCAST E. coli disco- difusão Demais enterobactérias determinar a CIM Preferencialmente microdiluição com caldo MH preparado no dia do teste um manfdo a - 80 C Etest superesfma intermediários Vitek2 25 a 27% de falsa resistência

30 Outros Cloranfenicol Disco- difusão Rifampicina Não há critérios interpretafvos

31 Testes de sinergismo Em modelo murino sinergismo entre doripenem e amicacina mesmo com CIMs na faixa de resistência Amicacina + levofloxacino = antagonismo Hirsch et. al. J Infect Dis 2013;207:786 93

32 O que é melhor: PCR direto do swab retal ou cultura de vigilância? A cultura de vigilância detecta P. aeruginosa e Acinetobacter MDR além de ERC; Detecta novos alelos que podem não ser detectados pela PCR; Direcionamento precoce de conduta O uso de inibidores e potenciadores tem a limitação de detectar OXA- 48 por exclusão

33 Culturas de Vigilância Swab retal ou fezes CulFvo inicial em 10 ml de caldo TSB ou BHI com 1 disco de ertapenem (1mg/L)

34 Culturas de Vigilância Detecção de ERC NÃO 48h de incubação? Semear o swab no caldo BHI ou TSB com ertapenem (1mg/L) NÃO Incubar 12 a 24 horas Meio turvo? SIM SIM. Repicar em ágar cromogênico ESBL ou MacConkey com discos de ertapenem e meropenem ; incubar 18 a 24 h 37 C SIM SIM Sem turvação. Liberar negafvo Interpretar e liberar Testar todos os Fpos coloniais disfntos se halo do ertapenem < 27 mm LOLANS, K. et al. J Clin Microbiol 2010;48(3):

35 O que enviar para o LACEN ANVISA Qualquer isolado EDTA+ (infecção ou colonização) Não há necessidade de enviar não CESP (p. ex. K. pneumoniae)posifvas para ácido fenilbrorônico.

36 Obrigado!